Морфологические изменения миентеральных ганглиев при экспериментальном остром язвенном колите

Введение. По данным клинических исследований в последние годы отмечается увеличение распространенности воспалительных заболева- ний кишечника, таких как болезнь Крона и язвенный колит [1, 2]. В патогенезе этих заболеваний важную роль наряду с иммунной играет энтеральная нервная система (ЭНС) - собственная нервная система желудочно-кишечного тракта, состоящая из двух нервных сплетений - субмукозного и миен-терального, которые содержат нервные ганглии, в их составе различают нейроны и глиальные клетки [3, 4]. ЭНС регулирует функциональное состояние кишечника, его моторную и секреторную функции [5]. Структурные и функциональные нарушения ЭНС играют важную роль в развитии клинических проявлений воспалительных заболеваний кишечника. Однако, литературные данные, посвященные изменениям ЭНС при колитах, особенно у человека, фрагментарны [3, 6]. Авторы, исследовавшие ЭНС у пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника и у животных с экспериментальным колитом, чаще всего отмечают уменьшение числа нейронов в миентеральном и субмукозном сплетениях [7]. У больных язвенным колитом выявляется гиперплазия и гипертрофия энтеральных нейронов [3, 6].

Цель исследования - изучить морфологические изменения нейронов и глиоцитов миен-теральных ганглиев ободочной кишки при остром язвенном колите, индуцированном декстрансульфатом натрия у самцов мышей C57Bl/6.

Материалы и методы исследования. Работа выполнена на 10 половозрелых мышах самцах С57Bl/6, массой тела 20-28 г. Животных содержали в клетках при естественном освещении, температуре +20-22 ˚С., со свободным доступом к воде и пище. При работе с экспериментальными животными руководствовались приказом Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977. На проведение эксперимента получено разрешение биоэтической комиссии ФГБНУ «НИИ морфологии человека». Для индуцирования острого колита (n=5) питьевую воду в поилках на 5 дней заменяли 2,5% раствором декстрансульфата натрия (40 kDa, ApliChem). Контрольная группа мышей (n=5) получала питьевую воду. В течение эксперимента ежедневно проводили оценку общего состояния животных и проявлений колита, которые характе- ризовались загрязнением фекалиями анальной области, иногда с примесью крови. На 7-ые сутки животных опытной и контрольной групп выводили из эксперимента передозировкой диэтилового эфира. Ободочную кишку извлекали из брюшной полости, отмывали от содержимого фосфатносолевыми буфером комнатной температуры и разделяли на проксимальный, медиальный и дистальный отделы, которые фиксировали в жидкости Буэна и заливали в парафиновые блоки. Изготавливали продольно ориентированные гистологические срезы толщиной 10 мкм, затем окрашивали их гематоксилином и эозином и по методу Ниссля крезиловым фиолетовым.

Для морфометрии и фотосьемки использовали микроскоп Leica DM2500 (обьективы x10, x40, x100), оснащенный цифровой фотокамерой Leica DFC 295 с матрицей с разрешающей способностью 3,2 Мп. Использовали программное обеспечение ImageJ и графический планшет Wacom. Подсчет клеток в миентеральных ганглиях проводили визуально при увеличении 640 под микроскопом по глубине препарата. При оценке клеточного состава в 40 миентеральных ганглиях на каждом препарате подсчитывали нейроны центрального сечения с нормо-, гипо- и гиперхромным тигроидом, с ядром без ядрышка, гиперхромные пикнотические, нейроны с отчетливо визуализируемым тигроидом, но без ядра и глиальные клетки (рис. 1). Нейронами центрального сечения считали те нейроны, в которых определялось ядро с четкой границей и ядрышко (8). Глиальные клетки характеризовались относительно небольшим размером ядра с более плотным хроматином и от- сутствием тигроида. Определяли площадь 15 нейронов центрального сечения и их ядер в каждом препарате. Результаты морфометрии трех отделов ободочной кишки суммировались. Проводили статистическую обработку полученных данных в программах Statistica 8.0, AtteStat. Достоверность различий между показателями устанавливали с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни. Различия считали статистически значимыми при p < 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение. На 3-5 сутки от начала потребления декстрансульфата натрия общее состояние животных опытной группы по сравнению с контролем прогрессирующее ухудшалось, двигательная активность и потребление пищи снижались, отмечалась пилоэрекция. На 7-ые сутки эксперимента у всех мышей опытной группы выявлялось загрязнение анальной области фекалиями с примесью крови. При вскрытии животных опытной группы отмечалось уменьшение длины толстой кишки с чередованием зон расширения и сужения просвета. Содержимое толстой кишки у мышей опытной группы было жидким и темно-красного цвета, а в контрольной группе желто-коричневого цвета с увеличением плотности содержимого в дистальном отделе ободочной кишки.

При микроскопическом исследовании у животных опытной группы по сравнению с контролем во всех трех отделах ободочной кишки в слизистой оболочке отмечались язвы и эрозии, отек и воспалительная инфильтрация из макрофагов, нейтрофилов и лимфоцитов (рис. 2). Выраженность язвенного поражения была максимальной в

Рис. 1 Стенка дистальной отдела ободочной кишки мыши контрольной группы (А) и с острым язвенным колитом (Б). А - патологических изменений не выявляется; Б - острая язва представлена грануляционной тканью с выраженной воспалительной инфильтрацией. Отек и воспалительная инфильтрация подслизистого слоя. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 200.

Рис. 2 Миентеральный ганглии ободочной кишки мышей контрольной группы (А, Б) и при остром язвенном колите (В, Г): 1 – нормохромные нейроны; 2 – гипохромные нейроны ; 3 – гиперхромные нейроны;4 – нейроны с ядром без ядрышка;5 – пикнотические гиперхромные нейроны; 6 – нейроны без ядра;7 - глиальные клетки. Окраска по Нисслю. Ув.640.

дистальном отделе ободочной кишки. В мышечной оболочке и миентеральных ганглиях воспалительные изменения отсутствовали.

В миентеральных ганглиях у животных опытной группы по сравнению с контролем определялось очаговое разряжение нейропиля. При анализе клеточного состава миентераль-ных ганглиев выявлено статистически значимое снижение количества гипохромных и увеличение гиперхромных нейронов, снижение числа клеток нейроглии. Общее количество нейронов на ганглий при остром язвенном колите по сравнению с контролем статистически значимо не изменилось (табл.1), а площадь миентеральных нейронов центрального сечения и их ядер статистически значимо уменьшилась (табл. 2). Показатели глио-нейронального индекса миентеральных ганглиев и ядерно-цитоплазматического отношения нейронов при колите не отличались между группами (табл.1, табл. 2) .

В настоящей работе использована окраска гистологических препаратов по Нисслю крези- ловым фиолетовым, которая широко применяется нейроморфологами. Этот метод основан на взаимодействии щелочного красителя, например крезилового фиолетового, с нуклеиновыми кислотами, сконцентрированными в ядре или шероховатом ретикулуме нейронов [9]. Тинкториальные свойства (хромность) цитоплазмы нейронов зависят от состояния тигроида и отражают гетерогенность популяций нейронов [10].

По данным литературы, основанным на исследовании морфологических изменений нейронов в ЦНС, гипохромия нейронов с неизмененной морфологией ядра может быть связана с центральным хроматолизом, острым или гидропическим набуханием нейронов [10]. При центральном хроматолизе отмечается разряжение тигроида в центральных участках клетки, а ядро сдвигается к ее краю. При остром набухании тигроид разряжается и цитоплазма нейрона приобретает гомогенный вид. При гидропичесских изменениях нейронов вокруг ядра выявляются светлые вакуоли. Гиперхромия или сморщивание нейронов в ЦНС

Таблица 1.

Клеточный состав миентеральных ганглиев

Показатели на ганглий	Контроль	Острый язвенный колит	Отклонение от контроля, %	Достоверность различий, p
Нормохромные нейроны	0,58±0,03	0,59±0,03	+2%	0,82
Гипохромные нейроны	0,44±0,03	0,28±0,02	-36%	<0,05
Гиперхромные нейроны	0,08±0,01	0,18±0,02	+55%	0,05
Все нейроны центрального сечения	1,1±0,05	1,05±0,04	-5%	0,37
Нейроны с ядром не центрального сечения	0,32±0,03	0,34±0,03	+6%	0,49
Пикнотические нейроны	0,08±0,02	0,08±0,01	0%	0,77
Нормохромные нейроны без ядра	1,22±0,05	1,09±0,05	-11%	0,2
Глиоциты	1,95±0,08	1,38±0,06	-30%	<0,05
Глио-нейрональ-ный индекс	1,77	1,31	-26%

Таблица 2.

Площадь цитоплазмы и ядра миентеральных нейронов центрального сечения

Показатели	Контроль	Острый язвенный колит	Отклонение от контроля,%	Достоверность различий, p
Площадь нейронов в мкм²	103,11±3,34	90,32±2,26	-12%	<0,05
Площадь ядер в мкм²	46,88±1,06	43,56±0,85	-7%	<0,05
Ядерно-цитоплазма-тический индекс	0,48±0,01	0,50±0,08	+4%

у человека проявляется в уменьшении размеров нейронов и их ядер, слиянии гранул тигроида в темную массу [10]. Выраженная гиперхромия так называемых темных нейронов традиционно считается признаком их повреждения [11]. Конечным этапом повреждения нейронов является кариоцитолиз с появлением бледных клеток-теней, лишенных ядра. При использовании классических нейрогистологических методов окраски выделяют прогрессивные и регрессивные формы изменения астроцитов. При первом состоянии отмечается гипертрофия астроцитов и нередко их многоядерность, при втором сморщивание клеток и гиперхромия их ядер [10]. Следует отметить что по нашим наблюдениям в большинстве нейронов миентеральных ганглиев мышей опытной и контрольной групп ядро занимает эксцентрическое положение из-за небольшого размера клетки, а детальная оценка морфологии тигроида невозможна из-за небольшого размера цитоплазмы нейронов, вследствие чего экстраполяция данных, полученных на нейронах ЦНС у человека на нейроны миентеральных ганглиев у мышей затруднена. Выявленные при экспериментальном остром колите морфологические изменения ми-ентеральных ганглиев, такие как снижение числа гипохромных нейронов без изменений их ядер и ядрышек, отражают нарушения функционального состояния нейронов, а увеличение числа гиперх-ромных нейронов и уменьшение размеров их ядер и цитоплазмы, уменьшение количества глиоцитов и глиально-нейронального индекса - процессы их альтерации.

Литературные данные об изменении количества энтеральных нейронов и глиоцитов при колите противоречивы. При иммуногистохимическом исследовании энтеральной нервной системы большинство исследователей отмечает снижение количества нейронов при экспериментальном остром и хроническом колите [12 -17].

Ряд авторов указывает что количество нейронов при экспериментальном колите не изменяется [18, 19], имеются сообщения о парадоксальном увеличении числа энтеральных нейронов при колите (20). Количество глиальных клеток по данным литературы может как уменьшаться [17], так и увеличиваться [21 - 22].

Противоречия в результатах исследования количества нейронов и глиальных клеток в энтеральных ганглиях при остром колите может быть связано с тем, что высокоспецифические иммуногистохимические методы, применяемые для выявления клеточных популяций не позволяют идентифицировать клетки с выраженными изменениями в результате потери ими иммунореактивности [23]. Так в зонах некроза слизистой оболочки и подслизистого слоя при остром колите, индуци-рованом тринитробензолсульфоновой кислотой, описывается исчезновение иммунореактивных нейронов и глиальных клеток и постепенное их появление по мере стихания воспалительного процесса [24]. Поэтому оценка патологических изменений энтеральной нервной системы с помощью традиционного метода Ниссля является достаточно информативной.

Выводы. При декстраниндуцированном остром язвенном колите у самцов мышей C57Bl/6 общее количество нейронов на ганглий в ободочной кишке по сравнению с контролем не изменяется, но снижается число гипохромных нейронов и глиоцитов и увеличивается число гиперхромных нейронов на ганглий. Глио-нейрональный индекс уменьшается, что указывает на снижение трофической функции глиоцитов. Размеры нейронов и их ядер уменьшаются. Выявленные морфологические изменения миентеральных ганглиев ободочной кишки при остром язвенном колите могут обусловливать нарушения моторной и секреторной функции.