Морфологические изменения селезенки в условиях ожоговой травмы кожи

В изучении системных звеньев регуляции физиологических процессов ключевая роль в защите организма отводится иммунной системе. При этом в дезактивации антигенов участвуют ее центральные (тимус, красный костный мозг) и периферические (селезенка, миндалины и лимфатические узлы) органы. В этой связи изучение морфологических особенностей иммунокомпетентных органов при стрессорном воздействии представляет научный и практический интерес [1-7].

Одним из периферических звеньев иммунной системы является селезенка. Именно ей принадлежит роль иммунорегулятора и гемокорректора в стрессовых условиях. По мнению ряда исследователей, морфологические особенности селезенки служат маркерами ее функционального состояния [1-8]. Установлено, что в патогенезе ожогового процесса на уровне иммунной системы происходят процессы дезорганизации и дизрегуляции иммунитета, проявляющиеся развитием иммуносупрессивных реакций и изменением субпопуляционного состава нейтрофилов [9]. Также доказано, что в ответ на термическое повреждение в очаге ожоговой травмы высвобождаются медиаторы воспаления (гистамин, провоспалительные цитокины и др.) [1011]. Несмотря на имеющиеся в литературе данные, на сегодняшний день остаются малоизученными морфологические особенности селезенки в условиях ожоговой травмы кожи.

Целью исследования явилось изучение морфологических особенностей селезенки в условиях раневого процесса кожи.

Материал и методы исследований . Объектом исследования служили нелинейные крысы, мужского пола в количестве 50 особей средней массой 215 г. Их содержали в одиночных клетках во избежание межсамцовых конфронтаций и вторичных повреждений кожных покровов в полном соответствии с положениями Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (Страсбург, 1986), Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных (Москва, 1984), приказа Минздрава России от 01.04.2016 г. №199н «Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики» (GLP), требованиям комиссии Российского национального комитета по биоэтике при Российской академии наук. Научные эксперименты в рамках работы были одобрены локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО Астраханский ГМУ Минздрава России (протокол № 4 от 21.11.2016 г.).

Рандомизация крыс-самцов осуществлена следующим образом: 1-я группа (контроль) - интактные животные (n=10), 2-я, 3-я, 4-я и 5-я (n=10) группы состояла из животных, подвергшихся ожоговому повреждению кожи в дорсальной зоне тела и выведенные из эксперимента на 2-, 4-, 7- и 10-е сутки после ожога соответственно. При изучении стресс-реактивности животных после ожогового повреждения кожи принимали во внимание изменение массы селезенки, используемой в качестве одного из критериев оценки функционального состояния организма при стрессе.

Селезенку очищали от окружающих тканей, взвешивали, помещали в раствор 10 % забуференного нейтрального формалина (рН 7,4) и подвергали процедуре стандартной гистообработки. Окраска срезов – раствор гематоксилина Майера и эозин. Проводили морфологическое исследование гистологических препаратов в проходящем свете при увеличении ×400 и ×100 цифрового микроскопа «Альтами БИО 8» (ООО «Альтами», Россия), при использовании камеры 3 Мпикс и программного обеспечения Altami Studio 3.4x64/Ink. Для статистической обработки данных использовали программу STATISTICA Base, значимость различий между группами оценивали по критерию Стьюдента с поправкой Бонферрони. Статистически значимыми считали результаты с уровнем достоверности не менее 95 % (P≤0,05).

Результат исследований. В нормальных физиологических условиях в белой пульпе селезенки Т- и В-лимфоциты образуют скопления, периферические лимфатические оболочки и фолликулы, расположенные вокруг сосудов артерий среднего размера, центральных артерий. В красной пульпе, основу которой составляет ретикулярную ткань, содержатся все типы клеток крови [4, 10].

Изучение гистологических препаратов селезенки интактных крыс выявило умеренное кровенаполнение сосудов. В белой пульпе селезенки насчитывали среднее число лимфоидных узелков. Белая пульпа имела форму сферических капсул, характеризовалась плотным скоплением лимфоцитов, моноцитов, макрофагов. Т-зависимая зона представлена лимфоидными муфтами, В-зависимая зона – лимфоузелками. В ретикулярной ткани красной пульпы сосредоточены макрофаги, плазмоциты, лимфоциты, эритроциты и т.д. Красная пульпа предствлена стромой из ретикулярного комплекса тяжей красной пульпы, капилляров, вен. На наружной части лимфоидных узелков пролегала маргинальная зона с несформированными плазматическими клетками (Рисунок 1).

Рисунок 1 – Микрофотография селезенки интактных крыс. Гематоксилин-эозин. Ув.об.10, ок.10. КП – красная пульпа, ЛФ – лимфатический фолликул

В ходе определения весовых показателей органа было выявлено, что в условиях ожогового процесса на 2 и 4 сутки происходило снижение массы на 20% (P<0,05), что свидетельствовало об инволюции и иммунносупрессии.

Сравнивая межгрупповые различия, можно проследить спад-подъем показателей, причем пик снижения массы приходился на 4 сутки. В эти сроки масса органа уменьшилась на 27 % (P<0,01), по отношению к показателям интактных животных. Увеличение массы на 7 сутки на 8 % (P<0,05) свидетельствовало о внутриклеточной гиперплазии органа в данном этапе – стадии резистентности. В полуторанедельный период происходило повторное снижение массы на 10 % (P<0,05), по сравнению с недельным сроком. Однако в течение всех наблюдений послеожогового периода сохранялось уменьшение массы селезенки, по сравнению с контрольными значениямии (Таблица 1).

Таблица 1 - Относительная масса селезенки (мг/ 100 г) в динамике ожоговой травмы кожи, M±σ

Показатель	Контроль	Сроки исследования
		2-е сут	4-е сут	7-е сут	10-е сут
Масса (мг/ 100 г)	705,0±18,1	569,6±65,6*	513,4±38,7*	561,5±97,6*	526,4±61,3*

Примечание: * - P<0,05; ** - P<0,01;*** - P<0,001 - относительно контроля (t-критерий Стьюдента с поправкой Бонферрони для множественных сравнений)

Микроскопическое исследование селезенки крыс, получивших ожоговую травму кожи, выявило глубокие деструктивные преобразования. Ожоговое поражение кожи дорсальной части тела крыс сопровождалось нарушением гемоциркуляции селезенки, отечностью стромы и стенок сосудов, а также уменьшением лимфоидной ткани (Рисунок 2).

Ожоговая травма на 4 сутки послеожогового периода способствовала дезорганизации структурных особенностей стромы белой пульпы, уменьшив ее плотность. Клеточный состав был представлен в основном лимфоцитами. Маргинальный слой был менее выражен, по сравнению с картиной селезенки нормальных крыс. Клеточные изменения в строме красной пульпы сопровождались формированием внутрисосудистого и периваскулярного склероза. Отмечали признаки отечности стромы, очаги кровоизлияний, расширение и полнокровие сосудов(Рисунок 3).

У крыс, подвергшихся ожоговому воздействию кожи и не получавших лечение, на 7 сутки послеожогового периода в селезенке наблюдали более выраженные зоны белой пульпы и маргинального слоя. Обнаруживали лимфатические фолликулы. В красной пульпе определяли полнокровие сосудов (Рисунок 4).

На поздней стадии стресса на 10 сутки после ожогового воздействия белая пульпа имела невыраженную структуру, в периферийных зонах определяли лимфоциты. В красной пульпе отмечали полнокровие сосудов, признаки пролиферации ретикулярной стромы.

Рисунок 2 - Микрофотография селезенки крыс на 2 сутки после ожогового воздействия. Гематоксилин-эозин. Ув.об.10, ок.10. КП - красная пульпа, ЛФ - лимфатический фолликул, ОС - отечность и утолщение стенки сосуда, формирование внутрисосудистого и периваскулярного склероза

Рисунок 3 – Микрофотография селезенки крыс на 4 сутки после ожогового воздействия. Гематоксилин-эозин. Ув.об.10, ок.10. КП – красная пульпа, ЛФ – лимфатический фолликул,

ОС

отечность и утолщение стенки сосуда, формирование внутрисосудистого и периваскулярного склероза

Рисунок 4 – Микрофотография селезенки крыс на 7 сутки после ожогового воздействия.

Гематоксилин-эозин. Ув.об.10, ок.10. КП – красная пульпа, ЛФ – лимфатический фолликул

Рисунок 5 – Микрофотография селезенки крыс на 10 сутки после ожогового воздействия. Гематоксилин-эозин. Ув.об.10, ок.10. КП – красная пульпа, ЛФ – лимфатический фолликул

Результаты исследования показали деструктивные изменения селезенки в динамике ожоговой травмы кожи: значительные структурные преобразования селезенки отмечены в условиях развития стрессорной реакции – стадии тревоги (1–2-е сутки) и стадии резистентности общего адаптационного синдрома (4–7-е сутки), сопровождающиеся признаками отека и деструкции. Частичное восстановление клеточного состояния селезенки на фоне раневого процесса кожи к 10-м суткам указывало на активацию защитноадаптационных механизмов.

Изучение структурных особенностей селезенки показало тканеспецифичную физиологическую стресс-реакцию иммунного органа, что сопоставимо с имеющимися в литературе данными [1]. Результаты морфометрического исследования селезенки при иммобилизационном стрессе Клочковой С.В. с соавторами отражали признаки снижения и восстановления функциональной активности органа в условиях гиподинамии [5]. В исследованиях Черешнева В.А с соавторами показано, что в условиях холодовой нагрузки и токсической гемолитической анемии, вызванной введением фенилгидразина, селезенка имела меньший объем белой пульпы, отечность стромы и полнокровие сосудов, что указывало на развитие гемодинамических нарушений [7]. Изменения морфофункционального состояния селезенки отмечено у животных и при гиподинамическом стрессе [8]. Структурные преобразования селезёнки кроликов при стрессе в виде уменьшения метрических показателей соединительнотканной капсулы, лимфоидных фолликулов, мантийных и маргинальных зон, а также увеличения толщины трабекул за счёт утолщения трабекулярных артерий о снижении кроветворной и иммунной функций селезенки, приводящего к сдвигу адаптационных возможностей организма [2].

Полученные в нашем исследовании данные дополняют сведения о негативном влиянии ожогового воздействия на иммунную систему организма [6] и свидетельствуют о том, что структуры селезенки чувствительны к действию ожоговой токсемии, развивающейся в этом органе на фоне системного воспаления.

Заключение. Таким образом, на фоне ожогового процесса кожи происходят структурные преобразования селезенки, что связано с миграцией в кровеносное русло иммунокомпетентных клеток, и активацией иммунитета. Морфологические изменения селезенки влекут за собой торможение восстановительных и пролиферативных процессов, развитие окислительного стресса и, как следствие, угнетение защитных функций органа.

Таким образом, морфологические особенности селезенки подтвердили ее непосредственное участие в регуляции нормальных и патофизиологических состояний.