Морфологические особенности миокарда крыс при экспериментальном моделировании дефицита магния

В структуре патологии элементного статуса у населения России недостаточность магния занимает лидирующую позицию, наряду с распространенностью дефицита йода, кальция, железа и цинка [1]. Магний служит обязательным кофактором для более трехсот ферментов, регулирующих различные функции организма. Дефицит магния стимулирует выработку целого ряда цитокинов и других гуморальных факторов, активацию оксидантных процессов [5]. Первой мишенью для всех этих воздействий становятся выстилающий сосуды эндотелий, повреждение которого, по современным представлениям, является ключевым звеном атеросклероза, воспаления и тромобообразования [4]. Проведено множество исследований, подтверждающих тесную взаимосвязь дисфункции эндотелия с формированием атеросклеротического поражения сосудов [3]. Дисфункция эндотелия сопровождается повышением уровня молекул адгезии, что приводит к адгезии лейкоцитов, росту концентрации провоспалительных цитокинов, высокой сосу- дистой проницаемости, усилению окисления липопротеинов низкой плотности (ЛПНП), пролиферации и миграции гладкомышечных клеток, а также активации тромбоцитов. В связи с этим в последнее время значительно вырос интерес к выявлению механизмов взаимосвязи между недостаточностью магния и развитием поражения сосудов [6]. В экспериментах in vitro было показано, что внеклеточный магний участвует в регуляции активности эндотелия, в частности, способен влиять на синтез оксида азота [7], захват и метаболизм ЛПНП [8], пролиферацию и экспрессию генов в клетках. Ferre S. с соавт. показали, что низкая концентрация магния в эндотелиальных клетках ускоряет процессы старения, что может быть фактором риска развития атеросклероза [2].

Коронарные кровеносные сосуды чрезвычайно чувствительны к магниевому балансу. При снижении уровня магния возрастает тонус коронарных сосудов, что ведет к ишемическому повреждению миокарда [8].

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Изучение влияния алиментарной недостаточности магния на структурные изменения артерий миокарда у крыс.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования были выполнены на 30 половозрелых нелинейных белых крысах-самцах массой 170—260 г. Контролем служили животные, находившиеся на стандартном лабораторном пищевом рационе. Интактная группа животных ( n = 10) составляла контроль. У экспериментальных крыс ( n = 20) моделировали магнийдефицитное состояние. Для моделирования алиментарного дефицита магния животные содержались на магнийдефи-цитной диете «ICN Biomedicals Inc.» (Aurora, Ohio, США), которая включала 20 % казеина, 70 % крахмала, 0,3 % DL-метионина, 0,2 % холина битартрата, 5 % кукурузного масла, 1 % поливитаминной смеси, 3,5 % диеты составляла полиминеральная смесь AIN-76, не содержащая магния. Весь рацион готовился на деионизированной воде, эту же воду в ходе эксперимента использовали в качестве питьевой воды для животных, находящихся на диете.

Скорость и глубину развития гипомагнезие-мии контролировали, определяя концентрацию магния в плазме и эритроцитах крови спектрофотометрическим методом по цветной реакции с титановым желтым (Sigma, США) с измерением на спектрофотометре «СФ-26» (ЛОМО, Россия) в кювете с длиной оптического пути 1 см при длине волны 550 нм.

При снижении концентрации магния ниже 1,4 ммоль/л в эритроцитах и ниже 0,7 ммоль/л в плазме считалось, что у животных развилась ги-помагнезиемия средней тяжести. К началу восьмой недели магнийдефицитной диеты у животных наблюдалось статистически значимое снижение уровня магния в эритроцитах на 57 % и в плазме — на 47 % ( p < 0,05) по отношению к группе интактных крыс, после чего животных наркотизировали введением этаминала-натрия в дозе 40 мг/кг, внутрибрюшинно.

Для проведения гистологического исследования материал для исследования получали из левого желудочка на среднем уровне. Вырезали продольные и поперечные фрагменты, включающие все оболочки сердца, и фиксировали в 4%-м растворе нейтрального забуференного формалина (pH 7,4) в течение 24 ч. Заливали в парафиновые блоки по общепринятым гистологическим методикам. Парафиновые срезы толщиной 3—5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, по Масону, гематоксилином-основным фуксином-пикриновой кислотой (ГОФП) по Ли. Гистологические препараты также изучали в поляризованном свете.

Гистологические препараты фотографировали цифровой камерой «Canon» (Japan, 5.0 мегапикселей) на базе микроскопа «Axiostar plus» (Карл Цейс, Германия) с использованием объектива х10; х40 и окуляра х10. При морфологическом исследовании оценивали наличие воспалительной инфильтрации и признаков тромбообразования в стенке артериальных сосудов мышечного типа. Кроме того, определяли объемную плотность (ОП) кардиомиоцитов (Vv кмц, %), объемную плотность ядер кардиомиоцитов (Vv якмц, %), объемную плотность стромы (Vv с, %) и объемную плотность фуксинофильных кардиомиоцитов (Vv ГОФП+кмц, %), отношение объемной плотности стромы к объемной плотности паренхимы (Vvс/ Vvкмц). Проводили расчет базовых статистических показателей (M, m) с использованием парного t-критерия Стьюдента.

Для проведения электронно-микроскопического исследования кусочков миокарда размером 1 мм3 фиксировали в течение 12 ч в 4%-м растворе параформа на 0,1М какодилатном буфере. Уль-тратонкие срезы толщиной 50—90 нм получали на ультратоме «LKB-8800». Изучение проводили на электронном микроскопе «Tesla BS-500» при ускоряющем напряжении 60 кВ. Электронные микрофотограммы изготавливали на фотографической черно-белой бумаге «Унибром 160 БП».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

У животных интактной группы в изучаемых микропрепаратах сосудистая выстилка артерий мышечного типа была представлена эндотелием, состоящим из одного слоя плоских одноядерных клеток. Признаки воспалительной инфильтрации и склероза в стенке артериальных сосудов и тром-бообразования отсутствовали. Отмечалось умеренное полнокровие артериальных сосудов. Цитоплазма эндотелиоцитов однородная, слабо эозинофильная.

Кардиомиоциты у животных интактной группы [(ОП — (82,6 ± 1,3)] %, соединялись «конец в конец» с образованием мышечных волокон. Ядра кардиомиоцитов имели овальную вытянутую форму [(ОП — (7,2 ± 1,2)] %. Цитоплазма кардиомиоцитов была однородная, умеренно эозинофильная. Единичные кардиомиоциты окрашивались позитивно по Ли. В продольных срезах хорошо различалась поперечная исчерченность мышечных волокон, которая отражала наличие в сердечных миоцитах многочисленных миофибрилл, состоящих из темных и светлых участков. В поляризационном свете четко прослеживались анизотропные A- и изотропные I-полосы. В соединительнотканной строме преобладали фибробласты, коллагеновые и эластические волокна и кровеносные сосуды [(ОП — (17,4 ± 6,2)] %.

В группе животных с дефицитом магния были отмечены выраженные явления полнокровия ар- териальных сосудов мышечного типа. В сосудистой стенке прослеживались явления выраженного отека. В отдельных артериальных сосудах мышечного типа определялись поверхностные дефекты эндотелиальной выстилки. В области повреждения происходило формирование мелких пристеночных тромбов. Во внутренней, средней и наружной оболочках артерий отмечались признаки умеренно выраженной лимфоплазмоцитарной инфильтрации с отеком, которая распространялась периваскуляр-но и сочеталась с развитием склеротических изменений вокруг сосудов и в их стенке. В отдельных артериях определялось краевое стояние полиморфно-ядерных лейкоцитов и лимфоцитов. Цитоплазма эндотелиальных клеток была однородная, гомогенная, умеренно эозинофильная.

Объемная плотность кардиомиоцитов опытной группы достоверно снижалась по сравнению с контрольной (табл.). Ядра кардиомиоцитов сохраняли овальную вытянутую форму. Отмечалось достоверное увеличение (по сравнению с контролем) объемной плотности кардиомиоцитов с фуксинофильной цитоплазмой при окраске по Ли. ГОФП-позитивные кардиомиоциты располагались отдельными группами преимущественно перивас-кулярно в субэпикардиальных отделах миокарда левого желудочка. В эозинофильных мышечных сегментах при поляризационно-микроскопическом исследовании обнаружено сближение анизотропных дисков за счет укорочения изотропных (сегментарные контрактуры I—II степени). Объемная плотность стромы достоверно увеличивалась по сравнению с контрольной группой. Увеличение ОП стромы в сочетании с уменьшением ОП кардиомиоцитов характеризовалось увеличением соотношения Vv с/Vv ( р < 0,05).

Объемная плотность и объемное отношение основных компонентов миокарда крыс с алиментарным дефицитом магния ( M ± m )

* Cтатистически достоверные изменения ( р < 0,05).

При электронно-микроскопическом исследовании эндотелия мелких артериол миокарда обнаружено истончение цитоплазмы эндотелиоцитов, наибольшая толщина отмечалась в области ядра, которая выступала в просвет капилляра. В цитоплазме отмечалось множество пиноцитозных везикул, а также просветление матрикса за счет отека. Ядра эндотелиоцитов имели неровные контуры, глубокие инвагинации ядерной оболочки. Глыбки гетерохроматина распределялись по периферии ядра, а также в виде островков.

Гладкомышечные клетки мелких артериол располагались радиально. Их форма становилась неправильной. Форма ядра приближалось к округлой с неправильными очертаниями, увеличением количества нуклеоплазмы. В цитоплазме отмечалось просветление перинуклеарной области за счет внутриклеточного отека, в отдельных клетках увеличение количества митохондрий, уменьшение количества и смешение актиновых микрофиламентов на периферию клетки. Осмиофильные тельца располагались под плазмолеммой.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, у крыс с алиментарным дефицитом магния обнаруженные морфологические изменения свидетельствовали о развитии хронического воспаления в стенке кровеносных сосудов с последующим склерозированием и формированием мелкоочагового кардиосклероза, что в целом косвенно подтверждается данными Maier J., еt al., 2004. Данный процесс сопровождался увеличением объемной плотности соединительнотканной стромы преимущественно вокруг кровеносных сосудов, что существенно ухудшает кровоснабжение миокарда и способствует, по мнению Malpuech-Brugere, (2004), развитию гипоксических повреждений сердечной мышцы. Кроме того, имелись ультраструктурные изменения со стороны эндотелия мышечных артерий и артериол, которые свидетельствуют о возможности возникновения эндотелиальной дисфункции. Выраженные изменения в гладкомышечных клетках артериол свидетельствует о длительной вазоконстрикции, которая, возможно, способствует ишемическому повреждению миокарда.