Морфологические особенности поражения головного мозга при тяжелом течении COVID-19

The article can be used under the CC BY-NC-ND 4 license

Submitted 01.02.2023                         Revised 14.03.2023                         Published 31.03.2023

ОБОСНОВАНИЕ

В настоящее время не вызывает сомнений системный характер новой коронавирусной инфекции, так как при COVID-19 поражаются многие системы организма, в том числе центральная нервная (ЦНС). По данным литературы, частота выявления симптомов поражения ЦНС, таких как головная боль, головокружение, слабость, расстройства обоняния, вкусового и зрительного анализаторов, у больных COVID-19 достигает 88%. Симптомы наблюдаются как в остром периоде, так и после перенесенного заболевания, при этом ряд авторов указывает на повышение частоты их выявления с течением времени [1–5], что может быть обусловлено длительной персистенцией SARS-CoV-2 в головном мозге, подтвержденной методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) [6].

По данным патологоанатомических вскрытий в Москве, при COVID-19 выявляется следующая патология головного мозга: геморрагический синдром, тромботическая микроангиопатия, васкулит, менингит, тромбоз синусов твердой мозговой оболочки; ишемические инфаркты, кровоизлияния, гипоксическая и метаболическая энцефалопатия, тромботическая микроангиопатия, энцефалит [7, 8].

Вопрос о прямой нейротропности SARS-CoV-2 остается открытым. Обсуждается роль «псевдовирионов» — белков, кодируемых геномом SARS-CoV-2, таких как nsp2, nsp5, c145a, nsp7, которые повышают уровень фактора Виллебранда, экспрессию интерлейкина 6, воздействуют на белки эндотелиальных клеток, белки плотных контактов, вызывая эндотелиальную дисфункцию с повышением проницаемости сосудистой стенки [9]. Важная роль придается субъединице S1 спайк-белка SARS-CoV-2, которая рассматривается в качестве патогенассоциированного молекулярного паттерна (pathogen-associated molecular pattern, PAMP), вызывающего нейровоспалительные процессы независимо от вирусной инфекции путем активации TLR2 и TLR4 рецепторов [10]. Показаны механизмы неблагоприятного воздействия SARS-CoV-2 на гематоэнцефалический барьер, изменения проницаемости которого развиваются вследствие нарушения плотных контактов эндотелиальных клеток, их прямого повреждения вирусом, нарушения транспортных путей и их рецепторного аппарата, активации астроцитов и микроглии, а также миграции периферических иммунных клеток в ЦНС [11, 12].

Описаны неиммунологические, иммунологические и цитопатические механизмы действия ви- руса на ЦНС, реализуемые за счет коагулопатии, ассоциированной с гипоксическим и ишемическим повреждением головного мозга, нарушением проницаемости гематоэнцефалического барьера и эндотелиальной дисфункцией, с возможным проникновением вируса в мозг и развитием нейроим-мунного ответа [13–18].

Несмотря на большое число публикаций, посвященных COVID-19, до сих пор нет четкого понимания патогенетических механизмов, лежащих в основе морфологических изменений ЦНС под влиянием SARS-CoV-2. После объявления Всемирной организацией здравоохранения пандемии COVID-19 для всех медицинских работников, включая патологоанатомов, оптимизация работы в целях оказания любой помощи в борьбе с пандемией является приоритетной задачей. В резолюции прошедшего в июне 2022 года в Новосибирске съезда Российского общества патологоанатомов одобрена и признана приоритетной разработка вопросов патогенеза и патологической анатомии новой коронавирусной инфекции COVID-19 и ее последствий с использованием всего арсенала современных высокотехнологичных методов исследования.

Учитывая особенности ЦНС и трудности при сборе образцов, вскрытие головного мозга остается золотым стандартом для изучения морфологических изменений головного мозга при COVID-19 [19–21].

Цель исследования — охарактеризовать морфологические и иммуногистохимические изменения различных отделов головного мозга при тяжелом течении COVID-19.

МЕТОДЫ

Дизайн исследования

Неэкспериментальное (обсервационное) аналитическое ретроспективное рандомизированное неинтервенционное продольное исследование.

В данном исследовании проведен детальный анализ морфологических изменений головного мозга в 25 летальных исходах больных с тяжелым течением COVID-19, проходивших лечение в ГБУЗ г. Москвы «Научно-исследовательский институт скорой помощи им. Н.В. Склифосовского» Департамента здравоохранения Москвы (далее — Институт) в период с 2020 по 2022 г.

Критерии соответствия

Критерии включения : положительный результат ПЦР-исследования мазка изо рта и зева на наличие SARS-CoV-2.

кт ГА

Критерии исключения : острая постгипоксическая энцефалопатия/смерть мозга; острое нарушение мозгового кровообращения; наличие в анамнезе болезни Паркинсона, Альцгеймера, других демиелинизирующих заболеваний нервной системы; возраст старше 75 лет.

Описание вмешательства

Головной мозг фиксировали в течение 4 недель в 10% растворе забуференного нейтрального формалина, после чего промывали проточной водой и проводили макроскопическое исследование. Разрезы головного мозга проводили по модифицированному методу Фишера, т.е. фронтальными разрезами через каждые 1–1,5 см с использованием макротома, позволяющего получать серийные срезы головного мозга [22, 23].

Проводили забор фрагментов головного мозга из его различных отделов: блуждающие нервы, обонятельные луковицы и тракты, глазные нервы, префронтальная кора, моторная кора, базальные ядра (скорлупа, бледный шар, тело хвостатого ядра со стенкой центральной части бокового желудочка мозга), обонятельные треугольники, крючки гиппокампа, кора островков, миндалевидные ядра и пе-риамигдалярная кора, задний отдел гипоталамуса с сосцевидными телами, чувствительная кора, вентральные 2/3 таламусов со стенками III желудочка мозга, аммоновы рога с гиппокампальными извилинами, кора верхних и нижних теменных долек слева, центральная часть среднего мозга на уровне нижних бугорков четверохолмия, половины моста на уровне полного раскрытия IV желудочка мозга, участок моста мозга в области корешка левого тройничного нерва, кора полушарий мозжечка в области хорошо выраженных зубчатых ядер, зубчатые ядра, участок моста мозга в области корешков слуховых и лицевых нервов, сегмент шейного отдела спинного мозга, продолговатый мозг на уровне пирамид, продолговатый мозг на уровне нижних олив, поясные извилины лобных долей. Кроме этого, оценивали сонные артерии и артерии виллизиева круга (их также забирали для дальнейшего исследования). Таким образом, оценку морфологических изменений вещества головного мозга проводили на большом объеме материала.

Гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином, по методам ван Гизона и Нис-сля. Проводили иммуногистохимические реакции с антителами к S1 и S2 субъединицам спайк-белка и N-белку SARS-CoV-2, СD68 для оценки выражен- ности активации микроглии и CD8 для выявления цитотоксических Т-лимфоцитов.

Этическая экспертиза

Дизайн и особенности настоящего исследования рассмотрены на заседании Комитета по биомедицинской этике Института (ГБУЗ г. Москвы «Научно-исследовательский институт скорой помощи им. Н.В. Склифосовского» Департамента здравоохранения г. Москвы) 15.06.2021.

Статистический анализ

Результаты патологоанатомических исследований представлены в предварительном виде, так как набор и исследование материала продолжаются. Статистическая обработка будет выполнена позднее.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Объекты исследования

Большинство пациентов (23 из 25) умерли в первые 30 дней заболевания (средний срок заболевания составил 3 недели), 1 пациентка умерла через 5 недель, еще 1 — через 61 день от начала заболевания. Средний срок пребывания пациентов в клинике составил 10 дней.

Среди умерших пациентов было 15 женщин в возрасте от 34 лет до 81 года (средний возраст 65,3 года) и 10 мужчин в возрасте от 26 лет до 71 года (средний возраст 55,3 года), соотношение женщин и мужчин — 1,5:1.

У 4 (16%) пациентов из 25 во время обследования были выявлены симптомы дисциркуляторной энцефалопатии, когнитивные нарушения, выраженные интеллектуально-мнестические расстройства, снижение памяти. По анамнестическим данным, расстройств ЦНС, предшествующих COVID-19, не зафиксировано. У 1 (4%) пациента во время пребывания в клинике отмечены клаустрофобия и панические атаки; у 1 (4%) пациентки течение COVID-19 осложнилось кровоизлиянием в головной мозг, развившимся на фоне гипертонической болезни и ожирения.

Течение COVID-19 у всех пациентов было тяжелым, сопровождалось развитием вирусно-бактериальной пневмонии с дыхательной недостаточностью, потребовавшей искусственной вентиляции легких у 23 (92%) пациентов, у 12 (48%) — трахеостомии, у 3 (12%) — подключения системы экстракорпоральной мембранной оксигенации.

Непосредственной причиной смерти, по результатам патологоанатомических вскрытий, у 18 (72%)

умерших явился острый респираторный дистресс-синдром, обусловленный вирусной или вируснобактериальной пневмонией. У 3 (12%) умерших пациентов непосредственной причиной смерти была легочно-сердечная недостаточность, у 2 (8%) — массивная тромбоэмболия легочной артерии, у 1 (4%) — сепсис, еще у 1 (4%) — инфаркт миокарда с разрывом и гемотампонадой полости перикарда.

Необходимо отметить, что у всех умерших пациентов по клинико-анамнестическим данным и результатам патологоанатомических вскрытий выявлена коморбидная патология в виде гипертонической болезни (у 17/25; 68%), ожирения (у 11; 44%), постинфарктного кардиосклероза и ишемической кардиомиопатии (у 10; 40%), сахарного диабета (у 5; 20%), цирроза печени (у 2; 8%), хронической обструктивной болезни легких (у 1; 4%). У 19 (76%) пациентов выявлено сочетание нескольких коморбидных с COVID-19 заболеваний. Известно, что коморбидность является предрасполагающим фактором развития неблагоприятных исходов при заражении SARS-CoV-2 [24, 25].

Во всех наблюдениях диагноз новой коронавирусной инфекции подтвержден анамнестическими, клиническими, рентгенологическими и морфологическими данными, положительной прижизненной и посмертной ПЦР-диагностикой SARS-CoV-2.

Основные результаты исследования

При микроскопическом исследовании в разных отделах головного мозга обнаружены признаки нарушения кровообращения: полнокровие артериол, венул и капилляров; стазы эритроцитов (рис. 1) и тромбозы; мелкие периваскулярные кровоизлияния. Выявленные изменения обнаружены в веществе головного мозга и его оболочках.

У всех умерших во всех исследованных областях головного мозга обнаружены признаки периваскулярного и перинейронального отека с пикноти-ческими изменениями цитоплазмы и ядер нервных клеток. В зоне коры, а также в субэпендимальных отделах белого вещества больших полушарий выявлены более выраженные явления отека в виде спонгиоформных изменений (рис. 2).

В разных отделах головного мозга обнаружены более тяжелые дистрофические изменения нервных клеток в виде гидропической трансформации с вакуолизацией цитоплазмы и ядер, а также признаки некроза и цитолиза по типу изменений в результате ишемического повреждения нейронов (рис. 3).

Рис. 1. Головной мозг: полнокровие, стазы эритроцитов в капиллярах. Окраска гематоксилином и эозином, масштабный отрезок соответствует 50 мкм.

Fig. 1. Brain, hematoxylin and eosin stained section shows hyperemia, erythrocyte stasis in capillary vessels, scale bar 50 μm.

Рис. 2. Головной мозг: явления отека в виде спонгио-формных изменений. Окраска гематоксилином и эозином, масштабный отрезок соответствует 100 мкм.

Fig. 2. Brain, edema with spongioform changes. Hematoxylin and eosin staining, scale bar 100 μm.

Рис. 3. Головной мозг: признаки некроза и цитолиза по типу изменений в результате ишемического повреждения нейронов. Окраска гематоксилином и эозином, масштабный отрезок соответствует 50 мкм.

Fig. 3. Brain, ischemic damage like signs of necrosis and cytolysis of neurons. Hematoxylin and eosin staining, scale bar 50 μm.

▼ж^жтжтж LVAVAVAV ГАТАТ

Рис. 4. Головной мозг: перинейрональный сателлитоз (стрелки). Окраска гематоксилином и эозином, масштабный отрезок соответствует 50 мкм.

Fig. 4. Brain, perineuronal satelliteosis (arrows). Hematoxylin and eosin staining, scale bar 50 μm.

Наряду с изменениями в коре и субэпендимальных отделах больших полушарий головного мозга, спонгиоформные и дистрофические изменения выявлены и в различных отделах центральной части обонятельного анализатора: в обонятельных трактах, луковицах и треугольниках, продолговатом мозге, что может служить объяснением описанного в работах различных авторов нейронального пути проникновения SARS-CoV-2 в ЦНС [16, 18, 26].

Во всех наблюдениях выявлена глиальная реакция в виде слабой и умеренной пролиферации глии

Рис. 5. Головной мозг: положительная иммуногистохимическая реакция с антителами к S1-субъединице спайк-белка SARS-CoV-2 в нейронах и астроцитах. Масштабный отрезок соответствует 50 мкм.

Fig. 5. Brain, positive immunohistochemical reaction with antibodies to the S1 subunit of the SARS-CoV-2 spike protein in neurons and astrocytes. Scale bar 50 μm.

Рис. 6. Головной мозг: положительная иммуногистохимическая реакция с антителами к CD68. Масштабный отрезок соответствует 50 мкм.

Fig. 6. Brain, positive immunohistochemical reaction with antibodies to CD68. Hematoxylin and eosin staining, scale bar 50 μm.

по ходу нервных волокон, периваскулярного астро-цитоза, а также перинейронального сателлитоза, т.е. скоплений глиальных клеток вокруг нейронов, главным образом в коре разных отделов полушарий мозга, что подтверждает данные литературы [15] (рис. 4).

В 10 наблюдениях в различных отделах обонятельного анализатора и продолговатом мозге, а также в нейронах и астроцитах других отделов головного мозга выявлена положительная иммуногистохимическая реакция с антителами к S1 и S2 субъединицам спайк-белка SARS-CoV-2 (рис. 5). Именно инфицированию SARS-CoV-2 астроцитов через NRP1-рецепторы (нейропилин 1) придается в настоящее время важнейшая роль в понимании поражения нейронов при COVID-19. По данным исследователей из Бразилии, SARS-CoV-2, инфицируя астроциты, нарушает в них процессы метаболизма, поскольку цель метаболических процессов в астроцитах — поддержание жизнеспособности нейронов, их изменения влияют на морфофункциональное состояние нейронов. В одной из публикаций описано критическое для поддержания жизнеспособности нейронов при новой коронавирусной инфекции снижение уровня пирувата и лактата (энергетического субстрата для нейронов) в астроцитах [27].

Результат слабоположительной иммуногистохимической реакции с антителами к N-белку SARS-CoV-2 в единичных нейронах расценен нами как сомнительный, достоверного подтверждения активной репликации SARS-CoV-2 в веществе головного мозга методом иммуногистохимического исследования не получено, как и в подобных исследованиях других авторов [28, 29].

Экспрессия S-белка SARS-CoV-2 выявлена лишь в единичных эндотелиоцитах.

Несмотря на наличие структурных элементов SARS-CoV-2, воспалительная реакция в тканях головного мозга в виде лимфоцитарной инфильтрации и активации микроглии, оцениваемая по количеству CD68-позитивных клеток, была слабой (рис. 6).

Выявлены немногочисленные диффузно расположенные, преимущественно цитотоксические CD8-позитивные Т-лимфоциты, а также их небольшие периваскулярные скопления в белом веществе полушарий большого мозга и мозжечка и в стволе мозга (рис. 7).

Особое внимание обращает на себя наличие многочисленных крахмалистых (амилоидоподобных) телец вокруг микрососудов под оболочками разных отделов головного мозга и белом веществе области боковых желудочков, во всех исследованных отделах центральной части обонятельного анализатора (обонятельных луковицах, трактах и треугольниках), в крючках гиппокампа, стволе мозга, что нередко сочеталось с выраженными спонгиоформными изменениями, обусловленными отеком (рис. 8). Крахмалистые (амилоидоподобные) тельца — это сферические базофильные включения, обнаруживаемые в отростках астроцитов и иногда в аксонах, количество которых увеличивается с возрастом преимущественно в субпиальных и субэпендимальных областях вокруг мелких сосудов [30].

ОБСУЖДЕНИЕ

Выявленные при исследовании признаки нарушения кровообращения при COVID-19 в других органах, прежде всего в легких, подтверждают системный характер поражения при данном заболевании.

Признаки периваскулярного и перинейрональ-ного отека, тяжелые дистрофические изменения нервных клеток в виде гидропической трансформации с вакуолизацией цитоплазмы и ядер, признаками некроза и цитолиза объясняются ишемическим повреждением нейронов вследствие нарушения гемодинамики в сочетании с выраженной эндогенной интоксикацией при тяжелом течении заболевания, относящихся к описываемым в литературе неиммунологическим механизмам действия SARS-CoV-2.

С начала пандемии в литературе были описаны три вероятных пути проникновения SARS-CoV-2 в головной мозг: гематогенный, связанный с нарушением проницаемости гематоэнцефалического барьера; трансэндотелиальный; нейрональный, или путь ретроградного аксонального транспорта. Выявленная в нашем исследовании экспрессия S-белка SARS-CoV-2 лишь в единичных эндотели-оцитах ставит под сомнение трансэндотелиальный путь проникновения вируса в головной мозг. В ра-

Рис. 7. Головной мозг: положительная иммуногистохимическая реакция с антителами к CD8. Масштабный отрезок соответствует 50 мкм.

Fig. 7. Brain, positive immunohistochemical reaction with antibodies to CD8. Hematoxylin and eosin staining, scale bar 50 μm.

Рис. 8. Головной мозг: многочисленные крахмалистые (амилоидные) тельца. Окраска гематоксилином и эозином, масштабный отрезок соответствует 100 мкм.

Fig. 8. Brain, numerous сorpora amylacea. Hematoxylin and eosin staining, scale bar 100 μm.

боте обнаружены признаки, подтверждающие описываемый другими авторами нейрональный путь проникновения SARS-CoV-2 в ЦНС. Трансэпителиальный (трансназальный) путь подтверждается выявлением в 10 наблюдениях в различных отделах обонятельного анализатора и продолговатом мозге положительной иммуногистохимической реакции с антителами к S1 и S2 субъединицам спайк-белка SARS-CoV-2.

В исследовании подтверждены также описываемые в литературных источниках иммунологические механизмы воздействия вируса SARS-CoV-2. Во всех наблюдениях определялась глиальная реакция. Воспалительная реакция на наличие белков SARS-CoV-2 в веществе головного мозга во всех наблюдениях была слабой.

кт ГА

Признаков активной репликации SARS-CoV-2 в веществе головного мозга нами не выявлено, что может объясняться длительностью заболевания на момент наступления летального исхода.

Выявление многочисленных крахмалистых (амилоидоподобных) телец в различных отделах обонятельного анализатора у умерших от COVID-19 пациентов могут объяснить длительно существующие расстройства обоняния у пациентов, перенесших COVID-19, однако данная гипотеза требует дополнительного подтверждения в связи с преимущественно пожилым возрастом умерших пациентов исследуемой группы.

Выявленные нами на аутопсийном материале диффузные морфологические изменения вещества головного мозга при тяжелом течении COVID-19 по механизму образования можно разделить на две группы.

К первой группе относятся:

• •    нарушения кровообращения с полнокровием артериол, венул и капилляров, стазами эритроцитов и тромбозом сосудов, периваскулярными кровоизлияниями;

• •    признаки периваскулярного и перинейрональ-ного отека с пикнотическими изменениями цитоплазмы и ядер нервных клеток, а в зоне коры и в субэпендимальных отделах белого вещества больших полушарий — спонгиоформными изменениями;

• •    более тяжелые дистрофические изменения нервных клеток в виде гидропической трансформации с вакуолизацией цитоплазмы и ядер, признаками некроза и цитолиза по типу изменений в результате ишемического повреждения нейронов;

• •    глиальная реакция в виде слабой и умеренной пролиферации глии по ходу нервных волокон,

периваскулярного астроцитоза, а также пери-нейронального сателлитоза.

Эти изменения обусловлены главным образом пневмонией, коагулопатией и другими проявлениями инфекции, сопровождающимися гипоксией и ишемией головного мозга. Изменения сосудистой системы могут обусловливать нарушения мозгового кровообращения и прогрессирование дисциркуляторной энцефалопатии и сосудистой деменции у пациентов пожилого и старческого возраста с COVID-19.

Ко второй группе относятся:

• •    воспалительно-дегенеративные изменения с положительной иммуногистохимической реакцией

с антителами к S1 и S2 субъединицам спайк-белка SARS-CoV-2 в нейронах и астроцитах;

• •    слабая воспалительная реакция в тканях головного мозга в виде лимфоцитарной инфильтрации и активации микроглии, оцениваемая по количеству CD68-позитивных клеток, а также немногочисленным диффузно расположенным преимущественно цитотоксических CD8-позитивных Т-лимфоцитов с их мелкими периваскулярными скоплениями в белом веществе полушарий большого мозга и мозжечка и в стволе мозга;

• •    наличие многочисленных крахмалистых (амилоидоподобных) телец в области микрососудов в поверхностных участках разных отделов головного мозга и белом веществе в области боковых желудочков и центральной части обонятельного анализатора.

С изменениями второй группы связано возможное развитие тяжелых неврологических осложнений COVID-19, в частности, описанных в литературе энцефалитов, а также дегенеративных и аутоиммунных заболеваний центральной нервной системы у реконвалесцентов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты проведенного нами исследования частично подтверждают опубликованные в отечественных и зарубежных работах данные по основным путям проникновения SARS-CoV-2 в ЦНС, патогенетическим механизмам влияния COVID-19 на головной мозг, включая иммунологические и неиммунологические механизмы. Вместе с тем нами высказано сомнение по поводу важной роли трансэндотелиального пути проникновения вируса в головной мозг, который опровергается выявленной экспрессией S-белка SARS-CoV-2 лишь в единич- ных эндотелиоцитах в исследованных препаратах головного мозга.

Вопрос нейроинвазивного нейротропного потенциала SARS-CoV-2 остается открытым и требует проведения дальнейших исследований. По нашим данным, SARS-CoV-2 обнаруживается в ЦНС, однако признаков его активной репликации нами не выявлено. Результаты проведенных исследований могут свидетельствовать в пользу системного характера поражения при COVID-19, в том числе ЦНС.

Выявленные особенности летальных исходов пациентов при тяжелом течении COVID-19 с учетом возраста, пола, наличия коморбидной патологии, а также обнаруженные при морфологическом

эактика

исследовании сосудистые, нейродегенеративные и провоспалительные изменения головного мозга следует учитывать при наблюдении и лечении пациентов в период реконвалесценции.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ / ADDITIONAL INFORMATION

Вклад авторов. Авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией).