Морфологические преобразования в зонах Са2 и Са4 гиппокампа крыс при моделировании хронической алкогольной интоксикации и фармакологической коррекции соединениями сукцикард и цитрокард

Морфологические исследования особенностей и механизмов алкогольного повреждения головного мозга играют значительную роль в разработке средств, обращенных на коррекцию нейродегенеративных изменений, в том числе с позиции функциональных нарушений [5, 6]. В литературе имеются данные о том, что алкогольная интоксикация вызывает запуск механизмов компенсации и приспособления в головном мозге с преобладанием атрофии и развитие гибели нейронов [1, 4]. Механизм нейро- дегенеративных заболеваний состоит из множественных нейрохимических нарушений, конечным итогом которых является клеточная смерть [2], по этому исследования нарушений метаболизма в головном мозге при алкогольном повреждении определяют наличие постоянного внимания ученых для разработки лекарственных средств, нацеленных на коррекцию последствий алкогольного повреждения [3]. Среди средств, направленных на коррекцию нейродегенеративных нарушений, повышенный интерес привлекают естественные метаболиты нервной системы и их аналоги, примером таких представителей служат соединения цитрокард и сукцикард.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

С помощью морфометрических методик исследовать структурные изменения в зонах CA2 и CA4 пирамидного слоя гиппокампа крыс при моделировании хронической алкогольной интоксикации и фармакологической коррекции соединениями сукцикард и цитрокард.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование производилось на белых лабораторных крысах самцах 6-месячного возраста исходной массой 220–240 г. Содержание животных соответствовало правилам лабораторной практики (GLP) и приказу МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики», были учтены требования комиссии Российского национального комитета по биоэтике при Российской академии наук. Хронический алкоголизм моделировался на крысах путем замены питьевой воды 5%-м этиловым спиртом, подслащенным сахарозой (5 г сахара на 100 мл 5%-го раствора этанола) в течение 20 недель. Группа контроля получала воду. После прекращения 20-недельной алкоголизации в течение 28 дней животным лечебным курсом вводились изучаемые соединения сукцикард и цитрокард. Контрольные животные получали дистиллированную воду в эквивалентном объеме. По окончании курса введения изучаемых соединений животные подвергались эвтаназии путем декапитации под наркозом с целью забора головного мозга, фиксировали образцы головного мозга в 10%-м забуферен-ном формалине. По стандартной методике изготавливали парафиновые блоки и срезы толщиной 5–7 мкм, окрашивали гематоксилином и эозином, по методу Ниссля толуидиновым синим. Проводили качественный и количественный анализ пирамидного слоя гиппокампа. Исследование микропрепаратов проводилось с помощью микроскопа «Axio Lab. A1», фотодокументирование осуществляли камерой «AxioCam 105 color». Статистическую обработку данных проводили с использованием пакетов программ Excell и Statistica 6,0. Данные представляли в виде медианы с указанием интерквартильного интервала. Различия между группами оценивали по критерию Манна-Уитни, Краскела-Уоллиса и считали статистически значимыми при p < 0,05. Для проведения количественного анализа гистологических препаратов использовались морфометрические методы, с помощью которых были описаны плани- метрические свойства нейронов и их структур. Среди планиметрических свойств нейронов определялись абсолютные показатели нейронов, такие как: площадь перикарионов, площадь ядер нейронов, площадь цитоплазмы нейронов, выполнены измерения толщины пирамидного слоя гиппокампа. На основании полученных абсолютных показателей нейронов рассчитан относительный показатель – медиана относительной плотности нейропиля в пирамидном слое и определены медианы ядерно-цитоплазматического отношения нейронов гиппокампа.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИСЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При морфометрической оценке абсолютных показателей пирамидного слоя в зоне СА2 выявлено, что площадь перикарионов нейронов пирамидного слоя гиппокампа в группе «Сукци-кард» больше по сравнению с группой «Цитро-кард» на 5,53 % (табл. 1). В группе «Сукцикард» площадь перикарионов составила Ме 126,55 [110,87;143,8] мкм², данное значение на 36,43 % больше, чем в группе алкоголя (Ме 80,44 [64,46;97,48] мкм²), и на 13,83 % больше, чем в группе интакта (Ме 109,04 [98,32;127,13] мкм²), в группе «Цитрокард» площадь перикарионов составила Ме 119,54 [100,56;142,23] мкм², данное значение на 32,7 % больше, чем в группе алкоголя (Ме 80,44 [64,46;97,48] мкм²), и на 8,78 % больше, чем в группе интакта (Ме 109,04 [98,32;127,13] мкм²), сравнение всех групп проводили методом Kruskal-Wallis: p < 0,05.

Площадь ядер нейронов пирамидного слоя гиппокампа в группе «Сукцикард» меньше по сравнению с группой «Цитрокард» на 5,36 %. В группе «Сукцикард» площадь ядер нейронов составила Ме 85,91 [73,67;97,98] мкм², данное значение на 39,04 % больше, чем в группе алкоголя (Ме 52,37 [43,64;65,93] мкм²), и на 15,77 % больше, чем в группе интакта (Ме 72,36 [65,12;84,34] мкм²), в группе «Цитрокард» площадь ядер нейронов составила Ме 90,78 [75,42;105,19] мкм², данное значение на 42,31 % больше, чем в группе алкоголя (Ме 52,37 [43,64;65,93] мкм²), и на 20,29 % больше, чем в группе интакта (Ме 72,36 [65,12;84,34] мкм²), сравнение всех групп проводили методом Kruskal-Wallis: p < 0,05.

Площадь цитоплазмы нейронов пирамидного слоя гиппокампа в группе «Сукцикард» больше по сравнению с группой «Цитрокард» на 26,38 %. В группе «Сукцикард» площадь цитоплазмы нейронов составила Ме 39,8 [32,44;49,02] мкм², данное значение на 34,94 % больше, чем в группе алкоголя (Ме 25,89 [21,11;30,69] мкм²), и на 9,79 % больше, чем в группе интакта (Ме 35,9 [30,19;42,25] мкм²), в группе «Цитрокард» площадь цитоплазмы нейронов составила Ме 29,3 [21,46;39,05] мкм², данное значение на 11,63 % больше, чем в группе алкоголя (Ме 25,89 [21,11;30,69] мкм²), и на 18,38 % меньше, чем в группе интакта (Ме 35,9 [30,19;42,25] мкм²), сравнение всех групп проводили методом Kruskal-Wallis: p < 0,05.

Ядерно-цитоплазматическое отношение (ЯЦО) нейронов пирамидного слоя гиппокампа в группе «Сукцикард» меньше по сравнению с группой «Цитрокард» на 27,79 %. В группе «Сукци-кард» ЯЦО нейронов составила Ме 2,13 [1,79;2,69] мкм², данное значение на 6,57 % больше, чем в группе алкоголя (Ме 1,99 [1,71;2,35] мкм²), и на 6,57 % больше, чем в группе интакта (Ме 1,99 [1,77;2,29] мкм²), в группе «Цитрокард» ЯЦО нейронов составила Ме 2,95 [2,11;4,01] мкм², данное значение на 32,54 % больше, чем в группе алкоголя (Ме 1,99 [1,71;2,35] мкм²), и на 32,54 % больше, чем в группе интакта (Ме 1,99 [1,77;2,29] мкм²), сравнение всех групп проводили методом Kruskal-Wallis: p < 0,05.

Толщина пирамидного слоя гиппокампа в группе «Сукцикард» меньше по сравнению с группой «Цитрокард» на 26,7 %. В группе «Сук-цикард» толщина пирамидного слоя составила Ме 36,56 [24,34;47,37] мкм², данное значение на 18,49 % больше, чем в группе алкоголя (Ме 29,8 [25,3;35,6] мкм²), и на 11,26 % меньше, чем в группе интакта (Ме 41,2 [36,2;45,1] мкм²), в группе «Цитрокард» толщина пирамидного слоя составила Ме 49,88 [37,9;59,17] мкм², данное значение на 40,25 % больше, чем в группе алкоголя (Ме 29,8 [25,3;35,6] мкм²), и на 17,4 % больше, чем в группе интакта (Ме 41,2 [36,2;45,1] мкм²), сравнение всех групп проводили методом Kruskal-Wallis: p < 0,05.

Относительная плотность нейропиля пирамидного слоя гиппокампа в группе «Сукци-кард» меньше по сравнению с группой «Цитро-кард» на 17,83 %.

В группе «Сукцикард» относительная плотность нейропиля составила Ме 32,75 [28,54;38,21] мкм², данное значение на 18,29 % больше, чем в группе алкоголя (Ме 26,76 [24,05;33,61] мкм²), и на 4,27 % больше, чем в группе интакта (Ме 31,35 [28,07;39,08] мкм²), в группе «Цитрокард» относительная плотность нейропиля составила Ме 39,86 [33,89;46,32] мкм², данное значение на 32,86 % больше, чем в группе алкоголя (Ме 26,76 [24,05;33,61] мкм²), и на 21,34 % больше, чем в группе интакта (Ме 31,35 [28,07;39,08] мкм²), сравнение всех групп проводили методом Kruskal-Wallis: p < 0,05.

При морфометрической оценке абсолютных показателей пирамидного слоя в зоне СА4 выявлено, что площадь перикарионов нейронов пирамидного слоя гиппокампа в группе «Сукци-кард» меньше по сравнению с группой «Цитро-кард» на 13,7 % (табл. 2).

Таблица 1

Зона гиппокампа	Морфометрические показатели	Итоги измерения и вычисления морфометрических показателей
		Интактная группа	Алкоголизированная группа	Группа «Сукцикард»	Группа «Цитрокард»
СА2	Медиана площади перикарионов, мкм²	Kruskal-Wallis test: H ( 3, N = 572) = 167,0568 p < 0,05
		109,04 [98,32; 127,13]	80,44 *** [64,46; 97,48	126,55 [110,87; 143,8]	119,54 [100,56; 142,23]
	Медиана площади ядер, мкм²	Kruskal-Wallis test: H ( 3, N = 572) = 315,2373 p < 0,05
		72,36 [65,12; 84,34]	52,37 *** [43,64; 65,93]	85,91 [73,67; 97,98]	90,78 [75,42; 105,19]
	Медиана площади цитоплазмы перикарионов, мкм²	Kruskal-Wallis test: H ( 3, N = 642) = 500,7804 p < 0,05
		35,9 [30,19; 42,25]	25,89 [21,11; 30,69]	39,8 [32,44; 49,02]	29,3 [21,46; 39,05]
	Медиана ядерно-цитоплазматического отношения нейронов гиппокампа, число	Kruskal-Wallis test: H ( 3, N = 705) = 125,0734 p < 0,05
		1,99 [1,77; 2,29]	1,99 [1,71; 2,35]	2,13 [1,79; 2,69]	2,95 [2,11; 4,01]
	Медиана толщины пирамидного слоя, мкм	Kruskal-Wallis test: H ( 3, N = 826) = 141,9943 p < 0,05
		41,2 [36,2; 45,1]	29,8 *** [25,3; 35,6]	36,56 [24,34; 47,37]	49,88 [37,9; 59,17]
	Медиана относительной плотности нейропиля, %	Kruskal-Wallis test: H ( 3, N = 92) = 26,31642 p < 0,05
		31,35 [28,07; 39,08]	26,76 [24,05; 33,61]	32,75 [28,54; 38,21]	39,86 [33,89; 46,32]

* Различия между группами (интакт – алкоголь) статистически значимы (критерий Манна – Уитни)

Таблица 2

Зона гиппокампа	Морфометрические показатели	Итоги измерения и вычисления морфометрических показателей.
		Интактная группа	Алкоголизированная группа	Группа «Сукцикард»	Группа «Цитрокард»
СА4	Медиана площади пе-рикарионо, мкм²	Kruskal-Wallis test: H ( 3, N = 425) = 136,5352 p < 0,05
		89,09 [71,28; 100,94]	92,79 [81,81; 103,76]	106,95 [90,91; 119,04]	123,93 [109,03; 134,34]
	Медиана площади ядер, мкм²	Kruskal-Wallis test: H ( 3, N = 410) = 194,2468 p < 0,05
		52,74 [45,81; 58,19]	58,85 * [51,99; 66,29]	74,68 [62,91; 81,84]	87,44 [79,97; 95,75]
	Медиана площади цитоплазмы перикарио-но, мкм²	Kruskal-Wallis test: H ( 3, N = 507) = 51,19896 p < 0,05
		26,72 [22,85; 31,25]	35,93 *** [30,07; 41,3]	31,23 [25,9; 37,93]	34,49 [28,14; 43,73]
	Медиана ядерно-цитоплазматического отношения нейронов гиппокампа, число	Kruskal-Wallis test: H ( 3, N = 516) = 172,4859 p < 0,05
		2,1 [1,79; 2,41]	1,53 *** [1,28; 1,88]	2,18 [1,84; 2,67]	2,49 [2,05; 2,92]
	Медиана толщины пирамидного слоя, мкм	Kruskal-Wallis test: H ( 3, N = 496) = 41,81239 p < 0,05
		54,9 [41,3; 74,2]	45,7 [40,8; 54,9]	36,38 [23,68; 51,67]	52,56 [30,94; 74,46]
	Медиана относительной плотности нейропиля, %	Kruskal-Wallis test: H ( 3, N = 69) = 31,49301 p < 0,05
		34,03 [30,32; 37,6]	40,63 * [34,53; 50,03]	35,02 [26,45; 46,83]	58,17 [52,6; 65,5]

* Различия между группами (интакт – алкоголь) статистически значимы (критерий Манна – Уитни).

Измерения морфометрических показателей гиппокампа в зоне СА2

Измерение морфометрических показателей гиппокампа в зоне СА4

В группе «Сукцикард» площадь перикарионов составила Ме 106,95 [90,91;119,04] мкм², данное значение на 13,23 % больше, чем в группе алкоголя (Ме 92,79 [81,81;103,76] мкм²), и на 16,69 % больше, чем в группе интакта (Ме 89,09 [71,28;100,94] мкм²), в группе «Цитро-кард» площадь перикарионов составила Ме 123,93 [109,03;134,34] мкм², данное значение на 25,12 % больше, чем в группе алкоголя (Ме 92,79 [81,81;103,76] мкм²), и на 28,11 % больше, чем в группе интакта (Ме 89,09 [71,28;100,94] мкм²), сравнение всех групп проводили методом Kruskal-Wallis: p < 0,05.

Площадь ядер нейронов пирамидного слоя гиппокампа в группе «Сукцикард» меньше по сравнению с группой «Цитрокард» на 14,59 %. В группе «Сукцикард» площадь ядер нейронов составила Ме 74,68 [62,91;81,84] мкм², данное значение на 21,19 % больше, чем в группе алкоголя (Ме 58,85 [51,99;66,29] мкм²), и на 29,37 % больше, чем в группе интакта (Ме 52,74 [45,81;58,19] мкм²), в группе «Цитрокард» площадь ядер нейронов составила Ме 87,44 [79,97;95,75] мкм², данное значение на 32,69 % больше, чем в группе алкоголя (Ме 58,85 [51,99;66,29] мкм²), и на 39,68 % больше, чем в группе интакта (Ме 52,74 [45,81;58,19] мкм²), сравнение всех групп проводили методом Kruskal-Wallis: p < 0,05.

Площадь цитоплазмы перикарионов пирамидного слоя гиппокампа в группе «Сукцикард»

меньше по сравнению с группой «Цитрокард» на 9,45 %.

В группе «Сукцикард» площадь цитоплазмы перикарионов составила Ме 31,23 [25,9;37,93] мкм², данное значение на 13,08 % меньше, чем в группе алкоголя (Ме 35,93 [30,07;41,3] мкм²), и на 14,44 % больше, чем в группе интакта (Ме 26,72 [22,85;31,25] мкм²), в группе «Цитрокард» площадь цитоплазмы перикарионов составила Ме 34,49 [28,14;43,73] мкм², данное значение на 4,00 % меньше, чем в группе алкоголя (Ме 35,93 [30,07;41,3] мкм²), и на 22,52 % больше, чем в группе интакта (Ме 26,72 [22,85;31,25] мкм²), сравнение всех групп проводили методом Kruskal-Wallis: p < 0,05.

Ядерно-цитоплазматическое отношение (ЯЦО) нейронов пирамидного слоя гиппокампа в группе «Сукцикард» меньше по сравнению с группой «Цитрокард» на 12,44 %.

В группе «Сукцикард» ЯЦО нейронов составила Ме 2,18 [1,84;2,67] мкм², данное значение на 29,81 % больше, чем в группе алкоголя (Ме 1,53 [1,28;1,88] мкм²), и на 3,66 % больше, чем в группе интакта (Ме 2,1 [1,79;2,41] мкм²), в группе «Цитрокард» ЯЦО нейронов составила Ме 2,49 [2,05;2,92] мкм², данное значение на 38,55 % больше, чем в группе алкоголя (Ме 1,53 [1,28;1,88] мкм²), и на 15,66 % больше, чем в группе интакта (Ме 2,1 [1,79;2,41] мкм²), сравнение всех групп проводили методом Kruskal-Wallis: p < 0,05.

Толщина пирамидного слоя гиппокампа в группе «Сукцикард» меньше по сравнению с группой «Цитрокард» на 30,7 %. В группе «Сукцикард» площадь перикарионов составила Ме 36,38 [23,68;51,67] мкм², данное значение на 20,39 % меньше, чем в группе алкоголя (Ме 45,7 [40,8;54,9] мкм²), и на 33,73 % меньше, чем в группе интакта (Ме 54,9 [41,3;74,2] мкм²), в группе «Цитрокард» площадь перикарионов составила Ме 52,56 [30,94;74,46] мкм², данное значение на 13,05 % больше, чем в группе алкоголя (Ме 45,7 [40,8;54,9] мкм²), и на 4,26 % меньше чем в группе интакта (54,9 [41,3;74,2] мкм²), сравнение всех групп проводили методом Kruskal-Wallis: p < 0,05.

Относительная плотность нейропиля пирамидного слоя гиппокампа в группе «Сукци-кард» меньше по сравнению с группой «Цитро-кард» на 39,79 %. В группе «Сукцикард» площадь перикарионов составила Ме 35,02 [26,45;46,83] мкм², данное значение на 13,80 % меньше, чем в группе алкоголя (Ме 40,63 [34,53;50,03] мкм²), и на 2,82 % больше чем в группе интакта (Ме 34,03 [30,32;37,6] мкм²), в группе «Цитрокард» площадь перикарионов составила Ме 58,17 [52,6;65,5] мкм², данное значение на 30,15 % больше, чем в группе алкоголя (Ме 40,63 [34,53;50,03] мкм²), и на 41,49 % больше, чем в группе интакта (Ме 34,03 [30,32;37,6] мкм²), сравнение всех групп проводили методом Kruskal-Wallis: p < 0,05.

Полученные морфометрические данные демонстрируют достоверные наличие изменений морфометрических параметров нейронов пирамидного слоя гиппокампа. Такого рода изменения, по нашему мнению, могут расцениваться как результат наличия нейропротектив-ных свойств у исследуемых лекарственных средств, приводящих к снижению выраженности патологических изменений в гиппокампе крыс вызванных длительной алкоголизацией (рис. 1, 2).

При этом отличительной особенностью оказалась выраженная изменчивость морфометрических параметров преимущественно в зоне СА2.

Рис. 1. Графики, отображающие динамику изменений морфометрических параметров – медианы площадей перикарионов нейронов гипокампа, медианы ядер площадей нейронов гиппокампа, медианы толщины пирамидного слоя гиппокампа, медианы плотности нейропиля гиппокампа в зоне СА2. Демонстрируется выраженные обратные изменения морфометрических параметров полученных от групп животных, получавших исследуемые соединения сукцикард и цитрокард

Рис. 2. Графики, отображающие динамику изменений морфометрических параметров – медианы ядерно-цитоплазматического отношения нейронов гиппокампа в зонах СА4 и СА2. Наглядно демонстрируется динамика выраженных обратных изменений морфометрических параметров от групп животных, получавших исследуемые соединения сукцикард и цитрокард

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исходя из полученных морфометрических данных можно заключить, что хроническая алкоголизация приводит к развитию атрофических процессов в гиппокампе крыс, коррекция исследуемыми лекарственными средствами способ- ствует меньшей выраженности патологических изменений и восстановлению структурных характеристик пирамидных нейронов СА2 и СА4, что свидетельствует о выраженных нейропротектив-ных свойствах исследуемых лекарственных соединений. При этом наиболее выраженное дей- ствие демонстрирует соединение Цитрокард, к тому же среди исследуемых зон гиппокампа СА2 и СА4 самой восприимчивой к действию исследуемых веществ оказалась зона СА2, что, в свою очередь, подтверждает наличие избирательной реактивности зон гиппокампа.