Морфологические реакции лабиринтной зоны плаценты белых крыс на парентеральное введение наночастиц золота разной величины

Введение. Пренатальный период развития животных и человека характеризуется большей чувствительностью к токсическим воздействиям, чем зрелый возраст. Многочисленными исследованиями показано, что ряд ксенобиотиков воздуха, пищи, воды могут вызывать осложнения при протекании беременности, а также оказывать эмбриотоксическое воздействие [1]. Потенциальное токсическое и морфогенетическое влияние веществ на развивающийся организм в первую очередь определяется состоянием плацентарного транспорта и проницаемости гемато-плацентарного барьера. В последние годы все более широкое применение в фундаментальных и прикладных биомедицинских исследованиях получают наноразмерные материалы [2]. Особое место среди наноразмерных материалов, применяемых для диагностических и терапевтических целей, занимают наночастицы золота, которые широко используются для оптической или магнитной визуализации структур клеток и тканей, как наноносители лекарственных и диагностических препаратов в ветеринарной и медицинской практике [3]. Исследование проницаемости плацентарного барьера в биомедицине ограничено некоторыми общепринятыми способами, в то время как нанотехнологии могут существенно расширить их спектр. Для решения этой проблемы можно использовать методы инъекций наночастиц, ассоциированных с лекарственными коньюгатами, которые способны избирательно (таргетно) накапливаться в тканях плаценты и развивающегося плода [4]. Однако применению нанотехнологичных подходов во время беременности должно предшествовать изучение проницаемости самих наночастиц золота через гематоплацентарный барьер и возможных морфологических реакций плаценты, её модулирующих.

Цель исследования - изучить морфологических реакции лабиринтной зоны плаценты белых крыс на парентеральное введение наночастиц золота и уровня их накоплений в тканях плода.

Материал и методы исследования. Эксперимент был проведен на самках белых беспородных лабораторных крыс, которым на 15-е сутки беременности в хвостовую вену вводили 0,7 мл суспензии пэгелированных наночастиц золота (в концентрация 80 мкг/кг животного) со средним размером 5, 10, 30, 50 и 150 нм. Использованные в исследовании золотые наночастицы были синтезированы в лаборатории биосенсоров и наноразмерных структур ИБФРМ РАН (г. Саратов, зав. лабораторией – д.ф.-м.н., проф. Н.Г. Хлебцов). Выбор крыс в качестве подопытных животных определялся сходным с человеческим типом плаценты (гемохориальный тип), а также типичным для млекопитающих строением органов половой системы [5]. Гемохориальная плацента белых крыс состоит из зоны гигантских клеток трофобласта, промежуточной зоны и лабиринта, которые представляют собой собственно гемато-плацентарный барьер и участвуют в трансплацентарном обмене между материнской и фетальной кровью. Контрольной группе животных на 15-е

Таблица 1.

Содержание золота (мкг/г) в плодах после парентерального введения беременным крысам препаратов наночастиц золота разной величины

Примечание: * - статистически значимые по критерию t отличия показателей от животных контрольной группы (p<0,05).

сутки беременности вводили физиологический раствор аналогичного объема. Кроме того, была использована интактная группа животных. Каждая группа была представлена не менее 6 животными. Через сутки после введения наночастиц золота или физиологического раствора животных выводили из эксперимента под хлороформным наркозом. Все эксперименты, уход и содержание осуществлялись в соответствии с Директивой № 63 от 22 сентября 2010 года Президиума и Парламента Европы «О защите животных используемых для научных исследований», «Санитарными правилами по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник от 06.04.1993 и приказом Минздрава РФ № 267 от 19.06.2003 «Об утверждении правил лабораторной практики». На исследования было получено разрешение локального этического комитета ФГБОУ ВПО «Ульяновский госуниверситет» Минобрнауки РФ. Препараты плаценты животных фиксировали в 10% нейтральном формалине, заливали в парафин и изготавливали срезы толщиной 5-6 мкм. Для морфологического анализа проводили окраску гематоксилином и эозином по стандартной методике. Для морфометрического исследования применяли компьютерную виде-отестсистему, включающую микроскоп «Motic», цифровую видеокамеру «JVC» («VICTOR COMPANY OF JAPAN», Япония) и компьютерную программу денситофотометрии «МЕКОС-Ц1» («Медицинские Компьютерные Системы (МЕКОС)», Россия). Морфометрия включала измерение массы плаценты, относительных площадей материнских лакун лабиринтной зоны, стромы балок и площади фе- тальных сосудов. В процессе морфометрических исследований руководствовались рекомендациями Г.Г. Автандилова [6]. Для оценки проницаемости гематоплацентарного барьера для золотых наночастиц использовали метод атомной абсорбционной спектроскопии (Dual Atomizer Zeeman AA spectrometer iCE 3500, Thermo Scientific Inc., USA), позволивший определить концентрацию золота в тканях плодов при использовании их целостных препаратов. Для визуализации накопления наночастиц золота в клеточных и тканевых структурах плаценты и тканях плодов применяли метод автометаллографии нитратом серебра на парафиновых гистологических срезах в собственной модификации [7].

Результаты исследования и их обсуждение. В настоящем исследовании установлена проницаемость наночастиц золота размером 5, 10, 30 и 50 нм через гемато-плацентарный барьер лабораторных белых крыс in vivo. С помощью метода атомной абсорбционной спектроскопии установлено, что в целостных препаратах плодов экспериментальных групп тотальное содержание наночастиц золота статистически значимо превышает таковое плодов от животных контрольной группы в среднем в 8 раз (см. табл. 1, статистическая значимость различий на уровне p<0,005). Содержание золота в препаратах плодов интактных животных - 0,12±0,03 нг/г и животных контрольной группы, которым вводили физиологический раствор - 0,11±0,07 нг/г, было практически идентично. Наибольшее содержание установлено в препаратах плодов животных, подвергшихся введению препарата наночастиц

Таблица 2.

Морфометрические показатели лабиринтной зоны плаценты белых крыс при введении препаратов наночастиц золота разной величины

Примечание: * - статистически значимые различия показателя с показателем животных интактной группы (p<0,05)

золота размером 50 нм - 6,58±1,9 нг/г (табл. 1). Не обнаружено существенных различий для проницаемости через гемато-плацентарный барьер к плоду наночастиц золота размером от 5 до 30 нм. Согласно полученным результатам можно полагать, что наночастицы золота размером 150 нм практически не проникают через плацентарный барьер. В препаратах плодов от животных, которым вводили наночастицы размером 150 нм, содержание золота составило 0,09±0,03 нг/г, что равно показателю группы интактных животных и животных контрольной группы. Однако эти результаты требуют гистохимического обоснования и количественного подтверждения циркуляции и большего содержания тканевого золота в тканях и органах беременных самок соответствующей группы.

Автометаллография гистологических препаратов органов и тканей плодов позволила выявить органы основного накопления наночастиц золота – наночастицы определялись в их печени и селезенке. Гистохимически было подтверждено, что гемато-плацентарный барьер животных с хориальным типом плаценты непроницаем для наночастиц золота размером 150 нм. Результаты автометаллографии не позволили выявить наночастицы золота в тканях плодов.

Масса плацент животных, подвергшихся введению суспензий наночастиц золота разной величины, не имеет статистически значимых различий по сравнению с аналогичными показателями животных как интактной, так и контрольной групп (p>0,05, табл. 2). Плацента всех групп животных имеет типичное строение. Лабиринт представ- лен трофобластическими балками, которые со стороны лакун омываются материнской кровью, внутри балок определяются фетальные сосуды. Вся лабиринтная зона плаценты животных всех экспериментальных групп полностью дифферен-цированна и соответствует гестационному сроку. Лабиринтные балки имеют трехслойное строение и представлены одним слоем трофобласта и двумя эпителиальными слоями. Балки всех групп животных хорошо васкуляризованы, бессосудистые балки обнаружены не были. Для животных контрольной группы характерны умеренно расширенные материнские сосуды, более полнокровные по сравнению с фетальными сосудами (рис. 1, «А»).

Нами установлено, что парентеральное введение раствора наночастиц золота беременным самкам белых лабораторных крыс обуславливает увеличение относительной площади материнских лакун по сравнению с аналогичным параметром плаценты животных интактной группы (p≤0,05). Вероятно, это вызвано введением дополнительного объема жидкости в кровоток животных. На это косвенно указывает отсутствие статистически значимых различий в показателях относительной площади материнских лакун животных, которым вводили суспензии наночастиц золота, и животных, подвергшихся введению физиологического раствора в равном объёме (табл. 2). Относительная площадь фетальных сосудов для всех групп животных не различалась.

Кроме того, для материнских лакун лабиринтной зоны плаценты животных, подвергшихся введению наночастиц золота и физиологического раствора, характерны полнокровие, эритроцитар-

Рис. 1. Микрофото лабиринтной зоны плаценты белой крысы на 15-е сутки беременности: А – животного контрольной группы, Б – животного после внутривенного введения раствора наночастиц золота диаметром 5 нм. Окраска гематоксилином и эозином, Ув. 600.

ный стаз, а также незначительное присутствие сладжированных эритроцитов (рис. 1, «Б»). Количество форменных элементов крови в плодных сосудах умеренное, стаза крови не отмечено, редко встречаются пустые капилляры. Обращает внимание на себя тот факт, что парентеральное введение как суспензий наночастиц золота размеров, так и равного им объёма физиологического раствора обуславливает тенденцию к снижению относительной площади стромы трофобластических балок лабиринтной зоны плаценты. Для плацент животных, которым вводили суспензию частиц размером 5 нм и 150 нм различия статистически значимы (табл. 2). Это явление, вероятно, обусловлено более высоким уровнем давления материнской крови. Бессосудистые балки в полученных нами препаратах не обнаружены.

Таким образом, введение в кровоток беременных самок белых лабораторных крыс с гемохориальным типом плаценты суспензий наночастиц золота разной величины вызывает в её лабиринтной зоне ряд морфологических изменений, которые не имеют специфического характера. Изменения сводятся к морфологическим проявлениям нарушения кровообращения, полнокровия, эритроцитарного стаза, расширения материнских лакун. Судя по степени выраженности этих реакций, они, скорее всего, обусловлены не собственно самими наночастицами, как препарата золота, а введением некоторого дополнительного объема жидкости в кровоток беременной самки, нарушающей общую гемодинамику. Критическим размером, ограничивающим проницаемость наночастиц через тканевые барьеры плаценты, является величина в 150 нм.

Наноразмерные объекты могут служить в ка- честве потенциального инструмента для управления процессами морфогенеза [8]. Исследование их проницаемости для тканевых барьеров является ключевым вопросом в разработке способов их применения [9, 10]. Практическое использование результатов этих исследований может стать основой создания нано-фармацевтических препаратов с селективной проницаемостью и накоплением в тканях для регуляции морфогенетических процессов, пренатальной диагностики и лечения. Полученные нами данные свидетельствуют о перспективности использования селективной размерной проницаемости наночастиц золота для целей тераностики (одномоментной терапии и диагностики) в период беременности, а также для исследования фундаментальных механизмов проницаемости тканевых барьеров у животных и человека.