Морфологическое исследование очага фокального ишемического повреждения коры головного мозга крыс на модели лазерного фотоиндуцированного тромбоза
Автор: Барсков Игорь Валентинович, Тактаров Владимир Германович, Иванова Мария Викторовна, Сергеев Владислав Александрович, Павлова Елизавета Алексеевна
Журнал: Вестник медицинского института "РЕАВИЗ": реабилитация, врач и здоровье @vestnik-reaviz
Рубрика: Морфология. Патология
Статья в выпуске: 3 (23), 2016 года.
Бесплатный доступ
Большую практическую значимость для неврологической клиники имеют исследования, направленные на изучение патогенеза ишемического повреждения ЦНС и поиск фармакологических препаратов, предназначенных для стимуляции регенераторных процессов при данной патологии. Одной из экспериментальных моделей, которая наиболее полно воспроизводит клиническую картину фокального ишемического инфаркта мозга, является фотоиндуцированный тромбоз кровеносных сосудов коры головного мозга. Преимуществом данной модели является то, что методика воспроизведения является неинвазивной, позволяет выбрать нужную локализацию ишемического коркового инфаркта, объем которого воспроизводится из опыта в опыт, что позволяет получить статистически достоверные количественные данные о степени повреждения мозга, динамике патологических и репаративных процессов в фокальном ишемическом очаге. Использование данной модели дает возможность количественной оценки нейропротекторного действия препаратов, используемых для фармакологической коррекции ишемической патологии мозга.
Ишемия, тромбоз сосудов головного мозга, фармакологическая коррекция ишемической патологии мозга
Короткий адрес: https://sciup.org/14344221
IDR: 14344221
Текст научной статьи Морфологическое исследование очага фокального ишемического повреждения коры головного мозга крыс на модели лазерного фотоиндуцированного тромбоза
Введение. В последние годы значительно увеличился объём исследований, направленных на изучение патогенеза ишемического повреждения центральной нервной системы и поиск фармакологических препаратов, предназначенных для стимуляции регенераторных процессов при данной патологии. Эти исследования имеют не только теоретическое значение, но и большую практическую значимость для неврологической клиники, поскольку известно, что тромбоз сосудов головного мозга является причиной приблизительно 75 % инсультов у человека, а число неблагоприятных исходов от цереброваскулярных заболеваний неуклонно растет как в нашей стране, так и за рубежом. При этом органическое поражение, как следствие ишемического повреждения ткани мозга, практически всегда приводит к двигательным и когнитивным расстройствам, которые значительно снижают качество жизни [1].
Одной из экспериментальных моделей, которая наиболее полно воспроизводит клиническую картину фокального ишемического инфаркта мозга, является фотоиндуцированный тромбоз кровеносных сосудов коры головного мозга [2, 3, 6, 7].
Методика, разработанная Ватсоном ((Watson B. et al., 1985) [7], основана на том, что при действии света с длиной волны 560 нм (что соответствует зеленому спектру лазера) на введенный в кровоток фотосенсибилизированный краситель бенгальский розовый (Bengal rose) или его аналог эритрозин Б. В области взаимодействия фоточувствительного красителя и фокусированного света выделяется синглетный молекулярный кислород, что приводит к повреждению эндотелия сосудов агрегации, адгезии форменных элементов крови и в конечном счете к тромботической окклюзии повреждённых кровеносных сосудов с последующей ишемизацией снабжаемых ими тканей (рис. 1). Следует отметить, что повреждение эндотелия происходит лишь в тех сосудах, до которых доходит возбуждающий свет, и площадь поражения при этом определяется размерами освещаемого участка.
Рис. 1. Схема формирования тромба
Таким образом, создается постоянный по объему и локализации очаг ишемического повреждения в определённой области коры мозга (рис. 2), а также окру ж ающая о ч аг область перифокального повреждения так называемая пенумбра (от лат. penumbra – полутень), где имеются погибшие, ишемизированные (гиперхромные) и неповреждён н ые нейроны.

Рис. 2. Зона инфаркта. Транскардиальная перфуз и я тушью. Докрашивание бенгальски м розовым. Бинокулярная лупа. Увеличение ×10
Целью настоящего эксперимента являлось морфогистологическое и сследование фокального очага ишемического повреждения, индуцированного лазерным фототромбозом кровеносных сосудов новой коры, а также стандартизация полученного ишемического очага по локализации и объему.
Преимуществом данной модели является то, ч т о методика воспроизведения является неинвазивной, позволяет выбрать нужную локализацию ишемического к оркового инфаркта, объем которого воспроизводится из опыта в опы т , что позволяет получить статистически достоверные количественные данные о степени п о вреждения мозга, динамике патологических и репаративных процессов в фокальном ишемическом очаге. И с пользование данной модели дает возможность количественной оценки нейропротекторного действия препаратов, используемых для фармакологической коррекции ишемической патолог и и мозга.
Материалы и методы . Основные правила содержания и ухода за экспериментальными животными соответствовали нормативам, данным в Приказе Минздрава России № 708н от 23.08.10 «Об утверждении Правил лабораторной практики» и были согласованы с этическим комитетом Минздравсоцразвития России. Для индукции фототромбоза животным, наркотизированным хлоралгидратом (300 мг/кг, внутрибрюшинно), в яремную вену (v. jugularis) вводили 3 %-й раствор фотосенсибилизируемого красителя бенгальского розового в дозе 40 мг/кг. Голову животного фиксировали в стереотаксисе и после продольного разреза кожи и удаления надкостницы, на расстоянии 1 мм от сагиттального шва, отступив 1 мм латераль-нее стереотаксической точки брегма в проекции правой и левой лобных долей, устанавливали лазер (длина волны – 560 нм, зеленый спектр). Облучение лобных долей проводили в течение 10 мин., после чего операционную рану ушивали. До индукции фототромбоза у всех животных был выработан условный рефлекс пассивного избегания (УРПИ). Постишемический период составлял 24 часа и 4 суток, после чего животным под глубоким хлоралгидрат-ным наркозом производили суправитальную транскардиальную перфузию фиксирующим раствором: формалин 40 % – спирт 96 % – ледяная уксусная кислота в пропорции 2:7:1 (ФУС). После перфузии мозг животных извлекали и помещали в спирт 70% для последующей гистологической обработки. Гистологический материал обрабатывали по общепринятым парафиновым методикам.
Гистологическое исследование очага ишемического повреждения. В течение 24 часов после фототромбоза в коре происходило формирование фокального ишемического очага. На гистологических срезах головного мозга, взятых у контрольной группы животных (без ведения N-АДА), окрашенных по Нисслю, в ишемическом очаге выявлялась зона тотального некроза, содержавшая необратимо поврежденные нейроны и зона т.н. «пенумбры» (от лат. penumbra – полутень), в которой обнаруживались нейроны с признаками повреждения (перицеллюлярный отек, гиперхромность, сморщивание тел нейронов, гомогенизация цитоплазмы, исчезновение глыбок хроматина, изменение конфигурации ядра), характерными для данной стадии постишемического периода (рис. 3А). Наблюдались также выраженный периваскулярный отек с диффузным смещением клеточных структур и нейронофагия. На гистологических срезах, окрашенных гематоксилином и ванадиевым кислым фуксином (VAF) [5] в пенумбре выявлялись множественные сморщенные ацидофильно окрашенные ишемизированные нейроны (рис. 3Б). Отмечалось стойкое снижение УРПИ.

Рис. 3А. Окраска по Нисслю. ×100 мкм

Рис. 3Б. Окраска гематоксилин-VAF. ×100 мкм
В гистологических препаратах головного мозга, взятых у экспериментальных животных на границе некротической зоны и пенумбры, отмечалась массивная глиальномакрофагальная реакция. В самой пенумбре преобладали нейроны с неизмененной структурой, а периваскулярный отек был выражен слабее.

Рис. 4. Морфометрический срез ишемического повреждения лобных долей коры головного мозга. Окраска метиленовым синим
Измерение объема очага ишемического повреждения фотоиндуцированным тромбозом. Для морфометрического измерения площади очага и объема ишемического повреждения использовали мозг экспериментальных животных, фиксированный методом погружения в смесь формалин 40 % – спирт, 96 % – уксусной кислоты (ФУС) в пропорции 2:7:1. После фиксации материал переносили на сутки в 70° спирт и резали в дистиллированной воде на вибратоме NVSLM1 World Precision Instruments с шагом 100 мкм. Каждый второй серийный вибратомный срез толщиной 100 мкм последовательно монтировали на предметных стеклах, покрытых желатиной, окрашивали 0,2 % раствором метиленового синего. Далее препараты обрабатывали по стандартной гистологической методике: обезвоживали в спиртах восходящей концентрации, просветляли в ксилоле и заключали в бальзам. Гистологические препараты сканировали на слайд-приставке сканера Epson perfection V100 PHOTO. Этот метод позволяет получить файл с изображением среза мозга нежно-голубого цвета, на котором четко виден очаг ишемического повреждения с темноокрашенной пенумброй по краю и светлый в середине (рис. 4).
Площадь ишемического повреждения промеряли с помощью программ анализа компьютерного изображения в относительных единицах и соотносили с площадью сканированного квадрата со стороной 10 мм, получая значение площади повреждения в мм2.
Результаты и обсуждение. На гистологических срезах препаратов контрольной группы, окрашенных как по Нисслю, так и гематоксилином – VAF уже через сутки выявляется фокальный участок с признаками начинающегося некроза, который почти не окрашивается. Хотя на этой стадии структура вещества мозга еще сохранена, некробиотические изменения уже появляются прежде всего в нейронах. При быстро развившейся недостаточности кровоснабжения вызванной лазерным фототромбозом, среди нейронов при окраске гематоксилин – VAF обна- руживаются клетки с ишемическими изменениями и гомогенизирующим некрозом, где наряду с простым цитолизом и острым набуханием можно обнаружить нейроны с гиперхроматозом (ацидофилией) и тяжелыми деструктивными изменениями.
На 4-е сутки в центральной зоне ишемического очага в результате воздействия протеолитических ферментов происходит деструкция всех клеточных элементов (паннекроз). При этом сморщенные ацидофильно окрашенные нейроны встречаются только в пенумбре. При выполнении данной работы была достигнута достаточно стабильная корреляция изменения поведенческих реакций (УРПИ) и морфологической картиной ишемических изменений в фокальном очаге коры лобных долей головного мозга. Это позволяет рекомендовать данную экспериментальную модель для доклинических испытаний фармакологических препаратов, обладающих нейропротекторными свойствами при ишемической патологии, а затем и для клинического применения в неврологической клинике c целью максимального уменьшения последствий ишемического повреждения головного мозга.
Список литературы Морфологическое исследование очага фокального ишемического повреждения коры головного мозга крыс на модели лазерного фотоиндуцированного тромбоза
- Гусев Е.И., Скворцова В.И. Ишемия головного мозга. -М.: Медицина, 2001. -328 с.
- Романова Г.А., Шакова Ф.М., Барсков И.В. и др. Ишемические очаговые повреждения коры; коррекция когнитивных расстройств и объема повреждения целлексом: материалы 5-й конференции «Гиппоксия: механизмы, адаптация, коррекция», Москва 9-11 октября 2008 г. -M.: Патогенез, 2008. -С. 84.
- Середенин С.Б., Романова Г.А., Гудашева Т.А. и др. Нейропротективное и амнестическое действие дипептидного миметика фактора роста нервов ГК-2 при экспериментальном ишемическом инфаркте коры головного мозга//Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2010. -Том 150, № 10. -С. 406-410.
- Хаспеков Л.Г., Бобров М.Ю. Эндогенная каннабиноидная система и её защитная роль при ишемическом и цитотоксическом повреждении нейронов головного мозга//Нейрохимия. -2006. -Том 23, № 2. -С. 85-105.
- Викторов И.В., Барсков И.В. Методика окрашивания ишемических нейронов головного и спинного мозга//Патологическая физиология и экспериментальная медицина. -1993. -№ 2. -С. 53.
- Барсков И.В., Тихобразова О.П., Евдокимова О.С. и др. Нейропротекторный эффект каннабиноида арахидоноилдофамина при фокальном инфаркте коры головного мозга крыс, вызванного фотоиндуцированным тромбозом//В сб.: X Всероссийский съезд неврологов с международным участием. -Нижний Новгород, 2012. -С. 18.
- Watson B.D. Animal models of photochemically induced brain ischemia and stroke//In: Pathophysiology, Diagnosis and Management. Cerebrovascular Desease. Blackwell Science. Eds. by Ginsberg M.D., Bogousslavsky J., 1998, v. 1, p. 52-73.