Мультиразделение антоцианов и антоцианидинов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с одновременным применением метода поверхности отклика

Антоцианы являются самой значимой и самой большой группой растворимых в воде пигментов, именно им многочисленные фрукты и овощи обязаны своей синей, пурпурной, красной или оранжевой кожурой. Антоцианы в своем естественном состоянии являются глюкозидами ядер соответствующих агликонов (антоцианидинов) с долей сахара. Различия между антоцианами вызваны числом гидроксильных групп, сущностью и количеством сахаров, привязанных к молекуле, позицией этих сахаров, а также природой и количеством алифатических или ароматических кислот, привязанных к сахарам [1]. Как известно, в растительных источниках всего было обнаружено более 600 различных антоцианов [2]. Большинство из них сформировано на основе шести наиболее распространенных антоцианидинов, вклю- чая цианидин (Cya), дельфинидин (Del), петунидин (Petu), пеларгонидин (Pelar), мальвидин (Mal) и пео-нидин (Peo) [3]. Антоцианы редко встречаются в природе в свободном состоянии (когда они не прошли процесс гликозилирования), потому что недостаток электронов в катионном флавилии приводит к большой реактивности данных соединений, вследствие чего молекула является нестабильной. Считается, что сахар в качестве скрепляющего соединения важен для стабильности пигмента. Подобные вещества встречаются, как правило, в виде 3-моноглюкозидов, 3,5-диглюкозидов или 3,7-диглю-козидов [4].

Антоцианы обладают определенными потенциальными антиокислительными свойствами, а также являются полезными для здоровья. Благодаря

полезным свойствам и растущей популярности, антоцианы и антоцианидины постепенно вытесняют искусственные пищевые красители.

Дневное потребление антоцианов в пищевом рационе жителей США оценивается примерно в 180–215 мг, в то время как потребление других пищевых флавонидов, таких как генистейн, кверцитин, или андапигенин, не превышает 20–25 мг в день–1 [5]. Антоцианы, предположительно, действуют как антиоксиданты путем выделения атомов кислорода для образования свободных радикалов с высокой реактивностью [6].

Существует несколько методов, применяющихся для определения антоцианов или антоцианидинов: среди них можно назвать УФ-ВИД [7], ВЖХ [8–10], ЖХ-МС [11–14] или капиллярный электрофорез [15, 16]. Однако во всех опубликованных работах речь обычно идет об определении общего количества антоцианов или антоцианидинов. Как выяснили исследователи, одновременное определение глюкозидов антоциана и агликонов антоцианидина затруднено вследствие различных полярностей, которыми обладают группа глюкозида антоциана и группа агликона антоцианидина [17]. Поэтому в данном исследовании основной задачей было добиться мультиразделения 12 антоцианов и антоцианидинов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с применением метода поверхности отклика.

Описание эксперимента. Материалы и реагенты. Стандартные антоцианидины, включая хлорид дельфидина, хлорид цианидина, холрид пеларгонидина, хлорид пеонидина и хлорид мальвидина, были приобретены у компании Sigma-Aldrich. Хлорид петунидина был приобретен у компании Chromadex. Стандартные антоцианы, включая пе-ларгонидин-3-глюкозид (Pelar-3-G), цианидин-3-глюкозид (Cya-3-G), пеонидин-3-глюкозид (Peo-3-G) и мальвидин-3-глюкозид (Mal-3-G), были приобретены у компании Sigma-Aldrich; дельфинидин-3-глюкозид (Del-3-G) и петунидин-3-глюкозид (Petu-3-G) – у компании Chromadex. Все остальные реагенты и химикаты были приобретены у компании Merck, и их качество соответствовало требованиям, предъявляемым к реагентам и химикатам для аналитического использования при ВЖХ.

Овощи и фрукты для анализа (красное яблоко, красный картофель, черный виноград, темные бобы и т.д.) были случайным образом приобретены на рынках и супермаркетах города Ханой (Вьетнам) и проанализированы с помощью оптимизированного метода.

Оборудование и процедуры. Все эксперименты проводились на жидкостном хроматографе Shimadzu LC 20AD series, оснащенном вакуумным дегазатором, бинарным насосом, автоматическим пробоотборником, колонной печью и матричным фотодиодным детектором. Инструментальный контроль, получение и анализ данных осуществлялись с помощью программного обеспечения LC Solution.

Разделение осуществлялось на колонке Sun Fire C18 с размерами 250 мм×4,6 мм×5 мкм с защитной колонкой. Объем впрыскивания равнялся 20 мкл с фотодиодной детекцией при 520 нм. В качестве элюционных растворителей использовались муравьиная кислота для воды и ацетонитрил – для специфических соединений.

Гомогенизированный образец взвешивался, а затем помещался в термоустойчивую колбу. Затем в колбу добавляли 30 мл метанола. Экстракция раствора происходила в течение 30 минут при 100 ° C. После охлаждения экстракт разбавляли и фильтровали при помощи 0,45-миллиметровой мембраны. И, наконец, полученный раствор анализировали при помощи ВЖХ с матричным фотодиодным детектором на предмет наличия в нем антоцианов.

Для определения антоцианидинов применялась следующая процедура: к экстракту антоциана добавлялась концентрированная соляная кислота, пока ее концентрация не достигала 2,4 М, после чего раствор нагревался на водной бане при температуре 90 ° C в течение 60 минут. Затем раствор охлаждали до комнатной температуры, разбавляли метанолом, фильтровали и анализировали при помощи ВЖХ с матричным фотодиодным детектором на предмет наличия в нем антоцианидинов.

Анализ данных. Данные анализировались при помощи статистического программного обеспечения Design-Expert Version 10.0.7 (Stat-Ease Inc., Minneapolis, MN, США). Факторная значимость рассчитывалась при помощи вариационного анализа (ANOVA), с ее оценкой и сведением к эффектам взаимодействия первого порядка. Для всех расчетов предполагалось, что эффекты взаимодействия более высокого порядка не вносили существенный вклад в поведение выбранной статистической модели, поскольку шансы на возникновение подобных эффектов были ничтожно малы.

Валидация метода. Эффективность оптимизированного метода была подтверждена следующими параметрами: линейностью и диапазоном, точностью, аккуратностью, пределом обнаружения и количественным определением. Результаты верифицированы в соответствии с жесткими требованиями, предъявляемыми к подобным процедурам Ассоциаций химиков-аналитиков (АОАС).

Результаты и их обсуждение. Выбор аналитических параметров ВЖХ. По причине разных полярностей антоцианов и антоцианидинов в качестве разделительной колонки была выбрана неполярная C18. Как известно, антоцианидины и антоцианы можно элюировать ацетонитрилом или кислотой, например, муравьиной в концентрации 0,05–10 %, трехфтористой уксусной кислотой в концентрации 0,05–0,1 %, ортофосфорной кислотой – 0,3–4,0 % или соляной кислотой – 5 mM [18–23]. В особенности муравьиная и трехфтористая уксусная кислоты широко использовались в данном процессе, потому что органические кислоты усиливают сигнал, и их следует добавлять в воду в качестве элюента. Использование неорганических кислот, таких как соляная или ортофосфорная, в высоких концентрациях могло оказать определенное влияние на функционирование хроматографической колонки. Поэтому в данном исследовании для разделения антоцианидинов и антоцианов использовались именно муравьиная и трехфтористая уксусная кислоты.

Предварительные эксперименты показали, что использование трехфтористой уксусной кислоты приводило к появлению резких, симметричных, но частично накладывающихся друг на друга пиков, в то время как 0,1%-ная муравьиная кислота полностью разделяла эти пики. Однако, так как муравьиная кислота слабее трехфтористой уксусной кислоты, можно было увеличить ее концентрацию для достижения более высокой чувствительности (получить более четкий пик). Поэтому для оптимизации разделения была выбрана именно муравьиная кислота.

Антоцианидины и антоцианы из-за своей разной полярности по-разному взаимодействуют со стационарными фазами. В процессе элюирования в изократном режиме они могут быть полностью отделены друг от друга, но анализ, вполне вероятно, может длиться примерно 50–60 минут, а сигнал может оказаться очень слабым. Поэтому необходимо изменить соотношение состава мобильной фазы и градиентной программы.

Помимо этого, скорость потока может оказывать значительное влияние на мощность элюирования, количество потребленного растворителя и продолжительность анализа. Для колонки C18 (250 мм × 4,6 мм × 5 мкм) была выбрана скорость потока, равная 0,6–1,0 мл/мин–1.

Затем проведена серия исследований для того, чтобы выяснить, при каких условиях разрешение четырех пар пиков (Pelar-3-G and Del, Del and Peo-3-G, Peo-3-G and Mal-3G, Peo и Mal) было выше 2 для достоверного определения веществ.

Оптимизация аналитических факторов методом поверхности отклика. Метод поверхности отклика – это набор математических и статистических инструментов для построения эмпирических моделей. Тщательное построение экспериментальных процедур призвано оптимизировать отклик (выходная переменная), на которую оказывают влияние несколько независимых переменных (входные переменные). Эксперимент проводится в виде серии тестов, в каждом из которых во входные переменные вносятся некоторые изменения с целью определить, какие причины вызывают изменения в выходной переменной.

Для того чтобы одновременно определить 12 антоцианов и антоцианидинов было совершенно необходимо достичь надлежащего их разделения. Следовательно, необходимо найти такое условие, при котором пики были бы абсолютно разделены, что означало, что разрешение пиков должно было быть достаточно высоким (больше 2). Был исполь- зован квадратичный центральный композиционный план с тремя независимыми факторами, включая концентрацию муравьиной кислоты в мобильной фазе (X1), начальную долю аецтонитрила в градиенте (X2), и скорость потока (X3). Откликами стали разрешения пиков, которые обычно невелики. Согласно нашим предварительным результатам, были выбраны следующие четыре отклика: разрешение между Pelar-3-G и Del (Y1), Del и Peo-3-G (Y2), Peo-3-G и Mal-3-G (Y3), Peo и Mal (Y4).

Количество экспериментов, проведенных над квадратичной центральной композиционной матрицей, было подсчитано по следующей формуле:

N = No+ N* + Nc, где N* – количество экспериментов в точке *, N* = 2n; Nc – количество экспериментов в центральной точке, No > 1; No – количество экспериментов в начальной точке, No = 2n–q (n – количество факторов, q – количество приведенных коэффициентов).

Для n = 3, q = 0 мы получили: N * = 6; N o = 8; N c = 6.

Таким образом, всего проведено 20 экспериментов ( n = 20) с 6 повторяющимися экспериментами в контрольной точке и на расстоянии от первоначальной точки до точки *, равном d = 2 ^{( n – q )/4} = 1,682.

С помощью программного обеспечения Design Expert оценен квадратичный отклик с тремя факторами; результаты приведены в табл. 1.

Таблица 1

Базовые уровни трех факторов с их кодами

Фактор	Уровень
	–1	0	+1
X 1 (концентрация муравьиной кислоты, % v/v)	5	10	15
X 2 (начальная доля ацетонитрила, %)	1	6,5	12
X 3 (скорость потока, мл/мин –1 )	0,6	0,8	1,0

Матрицы плана и соответствующие значения разрешений приведены в табл. 2. Все эксперименты выполнялись в случайном порядке с целью минимизации эффектов неконтролируемых переменных, которые могут привести к снижению точности измерений.

Приняв за аксиому подходящую полную квадратичную модель, описанную уравнением (1), мы получили математические модели для каждого отклика ( Y i ) в виде закодированных факторов после определения соответствия уравнению (1) по наименьшей квадратной регрессии (табл. 3).

Y = b 0 + t, b i x i + ±b j X i X j + ± b,x ‘ , (1) i = 1 1 < i <  j i = 1

где k – количество факторов (переменных); b 0 – параметр пересечения; b i , b ij и b ii – параметры регрессии для линейных эффектов, эффектов взаимодействия и квадратичных эффектов каждого фактора x_i соответственно.

Таблица 2

Экспериментальные матрицы плана закодированных переменных и изученных откликов

Ст. номер	Номер теста в серии	Закодированная переменная			Отклик
		X 1	X 2	X 3	Y 1	Y 2	Y 3	Y 4
19	1	10	6,5	0,8	2,641	3,483	2,344	2,696
3	2	5,0	12	0,6	5,044	0,468	4,525	2,394
15	3	10	6,5	0,8	2,637	3,609	2,381	2,717
4	4	15	12	0,6	1,838	1,566	3,206	3,415
9	5	1,6	6,5	0,8	1,589	0,729	3,227	1,601
1	6	5,0	1,0	0,6	1,229	0,000	0,548	0,140
8	7	15	12	1,0	2,271	2,272	2,988	3,122
10	8	18,4	6,5	0,8	0,685	3,040	3,345	3,549
7	9	5,0	12	1,0	4,479	0,611	3,522	2,579
20	10	10	6,5	0,8	2,641	3,483	2,344	2,696
6	11	15	1,0	1,0	1,527	3,010	2,593	3,438
11	12	10	0,0	0,8	1,250	0,832	0,717	2,495
14	13	10	6,5	1,1	2,663	3,500	2,143	2,405
12	14	10	15,7	0,8	4,560	0,000	3,878	3,639
13	15	10	6,5	0,5	2,669	1,271	1,817	0,943
5	16	5,0	1,0	1,0	0,000	1,673	0,997	1,932
16	17	10	6,5	0,8	2,630	3,438	2,325	2,717
18	18	10	6,5	0,8	2,639	3,430	2,326	2,695
2	19	15	1,0	0,6	1,436	0,877	1,382	2,427
17	20	10	6,5	0,8	2,625	3,462	2,338	2,713

Таблица 3

Уточненные уравнения регрессии и статистические параметры для изученных откликов

Отклик	Уравнение регрессии a	К.В. (%) b	Уточненный R 2	Прогнозируемый R 2	Адекватная точность
Y 1 c	Y 1 = 2,72 – 0,38 X 1 + 1,10 X 2 – 0,094 X 3 – 0,89 X 1 X 2 + + 0,29 X 1 X 3 – 0,54 X 12	9,22	0,9707	0,9286	37,040
Y 2	Y 2 = 3,49 + 0,65 X 1 – 0,15 X 2 + 0,62 X 3 + 0,13 X 1 X 3 – – 0,37 X 2 X 3 – 0,59 X 12 – 1,11 X 22 – 0,42 X 32	7,35	0,9878	0,9628	34,651
Y 3c	Y 3 = 2,32 + 0,057 X 1 + 1,03 X 2 + 0,072 X 3 – 0,54 X 1 X 2 + + 0,19 X 1 X 3 – 0,36 X 2 X 3 + 0,32 X 12 – 0,14 X 32	4,12	0,9904	0,9705	57,652
Y 4	Y 4 = 2,67 + 0,63 X 1 + 0,40 X 2 + 0,38 X 3 – 0,28 X 1 X 2 – – 0,16 X 1 X 3 – 0,36 X 2 X 3 + 0,13 X 22 – 0,36 X 32	4,44	0,9830	0,9433	46,720

П р и м е ч а н и е : ^a – получены путем обратного исключения условий, не являющихся значимыми ( P > 0,05), из полных моделей; ^b – коэффициент вариации; ^c – не являющиеся значимыми условия X 3 (в Y 1 ), X 1 (в Y 3 ) были включены в уравнение с целью поддержания иерархии модели.

Существует несколько потенциальных проблем, связанных с предполагаемой нормальностью модели, неравной дисперсией ошибок при обработке или блокировании и взаимодействием между обработкой и блокированием; следовательно, необходимо проверить адекватность предполагаемой модели. В данном исследовании проверка адекватности конечных уточненных моделей осуществлялась путем применения такого статистического инструмента, как адекватная точность и нормальный график распределения вероятностей для остатков. «Адекватная точность» определяет соотношение сигнала и помех. Желательным является соотношение выше 4. Соотношения 37,040, 34,651, 57,652, и 46,720 говорят о том, что сигналы вполне адекватны. Эта модель может использоваться для передвижения в плановом пространстве. Помимо этого, подобран- ная модель обычно оценивается при помощи коэффициента детерминации R2. Эта статистическая величина вызывает некоторые опасения, так как она всегда возрастает, когда в модель добавляются новые условия, даже если они не являются значимыми. Поэтому она обычно является более низкой для уточненной модели, чем для соответствующей ей полной модели. Для того чтобы преодолеть недостатки, связанные с применением R2, обычно используются уточненные коэффициенты R2. Следовательно, для получения более простой, но вместе с тем более точной модели из персональной модели были удалены условия, не являющиеся значимыми (p > 0,05). Хотя основной эффект X3 не являлся значимым условием для моделей, соответствующих Y1, а X1 не являлся значимым условием для моделей, соответствующих Y3, они были включены в оконча- тельные уравнения с целью соблюдения иерархии моделей. Помимо этого, значения оказались внутри разумного диапазона, с прогнозируемым коэффициентом R2 и в пределах приемлемого значения R2 ≥ 0,80, что означает, что полученные данные вполне соответствовали полиномиальным уравнениям второго порядка. Значения модели F указывали на то, что все четыре модели являются значимыми. Шанс того, что настолько большое значение F могло быть получено вследствие помех, равнялся 0,01 %. Значения, полученные для коэффициента вариации (К.В.) в процентах (измеряют воспроизводимость модели), были менее 10 % (от 4,12 до 9,22 %).

Как можно видеть из табл. 3 и рис. 1, факторы оказывали очень разные эффекты на отклики. Концентрация муравьиной кислоты и скорость потока имели положительный эффект на отклики Y 2 , Y 3 , Y 4 , и отрицательный эффект – на отклик Y 1 . Концентрация ацетонитрила оказывала положительный эффект на отклики Y 1 , Y 3 , Y 4 , и отрицательный – на отклик

Y 2 . Для разрешения Y 1 (pelar-3-G и Del), разрешения Y ₃ (Peo-3-G и Mal-3-G) условие X ₂ производило наиболее значимый эффект на разделение. Эти разрешения были увеличены X ₂. Взаимодействие между муравьиной кислотой и ацетонитрилом увеличивало разрешения, в то время как взаимодействие между ацетонитрилом и скоростью потока уменьшало их. Почти квадратичные условия производили негативные эффекты. Скорость потока оказывала менее значительный эффект на отклики, чем два других фактора, возможно, из-за ограниченного рабочего диапазона.

На рис. 1, б изображен эффект от концентрации муравьиной кислоты и скорости потока в разрешении Peo и Mal при сохранении доли ацетонитрила 6,5 %. Как можно увидеть, увеличение как концентрации муравьиной кислоты, так и скорости потока привело к постепенному увеличению разрешения. Это может быть объяснено тем, что антоцианы и антоцианидины являются стабильными

Рис. 1. Участки поверхностей отклика с отображением откликов: а – разрешение Pelar-3-G и Del как функция доли ацетонитрила и концентрации муравьиной кислоты; б – разрешение Del и Peo-3-G как функция скорости потока и концентрации муравьиной кислоты; в – разрешение Peo-3-G и Mal-3-G как функция скорости потока и концентрации муравьиной кислоты; г – разрешение Peo и Mal функция скорости потока и доли ацетонитрила

при pH < 3. Более высокая концентрация кислоты и более низкий уровень pH могут увеличить долю катиона флавилия, область пика и разрешение. Однако органические кислоты могут увеличить полярность мобильной фазы, что в результате приведет к меньшей мощности элюирования и, следовательно, к более длительному периоду удержания. Последующее сокращение периода удержания могло быть вызвано конкурирующим взаимодействием между молекулами муравьиной кислоты и полярными группами антоцианов для группы силанола на алкилированной силикатной поверхности при добавлении дополнительного объема органической кислоты.

При анализе простого отклика в плановом регионе определяются области, где процесс вероятнее всего даст желаемые результаты. Многие из проблем, связанных с методом поверхности отклика, приводят к тому, что анализировать приходится несколько откликов. Между тем одновременное рассмотрение многих откликов приводит к необходимости построить подходящую модель поверхности отклика для каждого отклика и определить такой набор рабочих условий, который в определенном смысле оптимизирует все отклики или, по крайней мере, сохраняет их в желаемом диапазоне. Настройки для оптимизации индивидуальных факторов и откликов с учетом многочисленных критериев приведены в табл. 4.

Применение этой стратегии в функции общей желательности позволило объединить цели, и полная желательность для оптимального решения была определена на уровне 0,748. С учетом вышеописанных условий и ограничений были получены следующие оптимальные расчетные параметры: концентрация муравьиной кислоты 10 %, доля ацетонитрила 10 % и скорость потока 0,80 мл/мин–1.

Таблица 4

Настройки для оптимизации индивидуальных факторов и откликов с учетом многочисленных критериев

Фактор/ Отклик	Цель	Нижний предел	Верхний предел	Важность
X 1	В диапазоне	5	10	3
X 2	В диапазоне	1	12	3
X 3	Цель = 1	0,6	1	3
Y 1	Максимум	0	5,044	2
Y 2	Максимум	0	3,609	5
Y 3	Максимум	0	4,525	5
Y 4	Максимум	0	3,639	4

Оптимизированные параметры ВЖХ были следующими: колонка C₁₈ Sun Fire компании Waters (250 мм х 4,6 мм х 5 мкм), мобильная фаза FA 10 % и ацетонитрила с градиентом: начиная с 10 % рост доли ацетонитрила 10–12 % за 0–10 минут, ацетонитрил на уровне 12 % в период 8,01–10,0 минуты, ацетонитрил постоянно на уровне 19 % в период 10,01–21,0 минуты, постоянно на 10 % в период 21,01–25,0 минуты, постоянно на уровне 10,5 % для последующего анализа; скорость потока: 0,8 мл/мин^–1. На рис. 2 изображена хроматограмма мультиразделения антоцианов и антоцианидинов с высокими разрешениями.

Порядок элюирования был следующим: (1) Del-3-G, (2) Cya-3-G, (3) Petu-3-G, (4) Pelar-3-G, (5) Del, (6) Peo-3-G, (7) Mal-3-G, (8) Cya, (9) Petu, (10) Pelar, (11) Peo, (12) Mal.

Валидация метода. Калибровочная кривая антоцианов и антоцианидинов была установлена в диапазоне концентраций 0,2–10 мг/л с коэффициентом корреляции > 0,9955. Предел обнаружения определяли постепенным добавлением небольших количеств стандартного раствора в пустые образцы

Рис. 2. Хроматограмма двенадцати антоцианов и антоцианидинов, полученная при оптимизированных условиях

до тех пор, пока сигнал не достигал 3. Результаты показали, что ВЖХ с применением матричного фотодиодного детектора обеспечивала достаточную чувствительность для определения антоцианов и антоцианидинов с пределом обнаружения 0,05–0,1 мг/кг. Точность оценивали при помощи шести повторов тестов на некоторых матрицах образцов. Относительное стандартное отклонение колебалось в пределах 1,91–6,45 %. Восстановление определяли путем добавления стандартных растворов в образцы сливы, сладкого картофеля при трех разных концентрациях. Тесты выполнялись в сериях по три повтора на каждую добавленную концентрацию. Были достигнуты уровни восстановления чистого образца в пределах между 85,4 и 109,6 %. Метод удовлетворял требованиям к восстановлению концентрации соответствующего аналита, установленным Ассоциацией химиков-аналитиков (AOAC).

Анализ продуктов, продаваемых на рынке. Образцы были случайным образом приобретены на рыках и в супермаркетах г. Ханой, Вьетнам. После гомогенизации образцы были проанализированы в соответствии с вышеописанной процедурой.

После экстракции некоторые антоцианы трансформировались в антоцианидины. Содержание антоцианидинов до и после гидролиза некоторых фруктов приведено в табл. 5 и показано на рис. 3.

Соответственно, содержание антоцианидинов было значительно выше, чем содержание антоциа-на-3-глюкозида, но в образцах были и другие типы антоцианов, исключая антоцианы-3-глюкозид. Среди них во фруктах и овощах наиболее часто встречался цианидин-3-глюкозид, другие же антоцианы были обнаружены в меньших количествах. Помимо этого, цианидин был и самым распространенным

Рис. 3. Содержание антоцианидинов в продаваемых продуктах

Таблица 5

Содержание антоцианов в продаваемых продуктах

Образец Содержание (мг/100 г) Слива Cya-3-G Pelar-3-G Peo-3-G Mal-3-G Красный картофель 1,57 – – – Темные бобы (кожура) – 1,05 – – Красное яблоко (кожура) 18,67 – 8,28 19,30 Чеснок (кожура) 11,23 – – – Баклажан (кожура) 8,4 – – – Яблоко (кожура) – – – – Красные бобы 27,17 – – – Виноград (кожура) 1,76 7,40 – – антоцианидином, который обнаруживался почти во всех образцах; за ним следовал дельфинидин.

В кожуре темных бобов содержалось наиболее разнообразное количество антоцианидинов, включая шести наиболее распространенных; также наиболее высоким было их общее содержание, которое превышало 600 мг в 100 г образца. Содержание ан-тоцианиднов также было высоким в кожуре винограда, более 450 мг на 100 г, основным из них был мальвидин. В образцах сливы, кожуры красного яблока, кожуры яблока и чеснока был обнаружен только цианидин. В красном картофеле и баклажанах были обнаружены только пеларгонидин и дельфинидин соответственно.

Выводы. Основной целью данного исследования было обнаружение оптимальных условий ВЖХ для одновременного разделения 12 антоцианов и антоцианидинов посредством серии экспериментов, проведенных согласно определенной процедуре. Доказано, что математические модели, разработанные для соотнесения разрешений и состава мобильной фазы, являются эффективной стратегией для оптимизации хроматографического метода. В рамках моделей обнаружено значительное совпадение между прогнозируемыми и наблюдаемыми данными, это означает, что данный метод подходит для анализа соединений. Метод позволяет одновременно определять антоцианы и антоцианидины в образцах овощей и фруктов за короткий период времени с высокой селективностью и чувствительностью. Процедура проста в применении и не требует значительных затрат, ее стоимость вполне разумна.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.