Мутации в гене-супрессоре ТР53 и их связь с особенностями клинического течения рака молочной железы

Молекулярной основой злокачественных новообразований, формирующихся под влиянием различных неблагоприятных факторов, являются многочисленные генетические нарушения, включающие хромосомные аберрации, мутации и эпигенетические изменения ключевых генов контроля клеточного деления и репарации ДНК, к числу которых относятся гены-супрессоры опухолевого роста. Одним из наиболее хорошо изученных генов-супрессоров является ген TP53 (каталожный номер в базе генов человека OMIM № 191117), регулирующий процессы контроля клеточного цикла, апоптоза, репарации ДНК и ангиогенеза [13]. Повреждения гена ТР53 (мутации) приводят к нарушениям указанных процессов и критичны для развития неоплазии. Соматические мутации гена ТР53 часто встречаются в большинстве злокачественных новообразований человека, а наследственные аберрации ТР53 предрасполагают к развитию широкого спектра ранних раков (синдром Ли-Фраумени) [20].

Наследственный рак молочной железы (РМЖ) диагностируется в 5–10 % случаев, но только 25 % случаев данного заболевания можно объяснить повреждениями в известных в настоящее время генах (BRCA1, BRCA2, TP53 и др.) [5], что касается спорадических случаев РМЖ, в опухолевых клетках частота мутаций гена ТР53 варьирует от 25 до 86 % в зависимости от стадии процесса и метода детекции [8, 14, 19]. По данным Международного агентства исследования рака (IARC), сформировавшего базу данных по ТР53, общее количество мутаций ТР53 в клеточных линиях и опухолях различных локализаций составляет 24810, при этом 2414 аберраций обнаружено при РМЖ [20]. Преобладающая доля аберраций ТР53 представлена миссенс-мутациями (75 %) в ДНК-связывающем домене, приводящими к аминокислотным заменам в белке р53 и ингибиции его связывания с генами-мишенями. Прочие изменения ТР53 включают в себя инсерции и делеции (9 %), приводящие к сдвигу рамки считывания, нонсенс- (7 %) и сайленс-мутации (5 %), а также другие редко встречающиеся аберрации, модифицирующие функциональные свойства белка онкосупрессора р53 [6,

• 20] . Мутации в гене ТР53, помимо изменения трансактивационных свойств, могут приводить к ингибированию связывания белка р53 дикого типа с генами-мишенями, а также явлению «gain of function» («приобретение новых функций»), в результате которого происходит индукция экспрессии генов рецепторов ростовых факторов ( EGFR, bFGF, VEGF), онкогенов ( с-Myc, с-Fos ) или взаимодействие с белками-супрессорами р63, р73, ведущее к последующему нарушению запуска апоптотической программы по р53-независимому пути. В опухолевых клетках с мутантным ТР53 также повышена экспрессия генов лекарственной устойчивости ( MDR1 ), что снижает чувствительность опухоли к химиотерапии [13, 22, 23].

Прогностическая значимость мутаций ТР53 при РМЖ была изучена в многочисленных исследованиях. Многими авторами была показана связь аберраций ТР53 с плохим прогнозом, причем мутации, находящиеся в области связывания с ДНК, ассоциировались с более неблагоприятным прогнозом заболевания [20]. Для больных РМЖ с локализованным процессом было показано, что мутации ТР53 чаще встречались в опухолях с амплификацией эпидермального фактора роста 2 (neu/erbB-2), являющегося фактором неблагоприятного прогноза заболевания [7, 18]. При этом риск рецидива заболевания и летального исхода был существенно выше у пациенток с мутациями ТР53 и амплификацией neu/erbB-2 по сравнению с больными, имеющими нормальный ТР53 [7]. На основании исследования профилей генной экспрессии с применением микрочиповой технологии было выявлено, что ТР53 мутации при дополнительном учете экспрессионных профилей ключевых генов контроля клеточного цикла, а также в сочетании со стандартными прогностическими критериями, такими как размер опухоли и вовлечение в процесс лимфоузлов, являются информативными предикторами выживаемости [15]. Другими авторами было показано, что мутантный статус ТР53 положительно ассоциирован с такими неблагоприятными признаками, как отсутствие на опухолевых клетках экспрессии рецепторов к эстрогенам и прогестерону, анеуплоидия и высокая пролиферация. При этом не было обнаружено взаимосвязи мутаций ТР53 с размером опухоли [9].

Таким образом, связь мутаций ТР53 с плохим прогнозом и неблагоприятным исходом заболевания достаточно четко определена, хотя до сих пор нет однозначного мнения о возможности использования их в качестве независимого прогностического критерия [10]. При этом в литературе редко встречаются данные о связи множественных мутаций гена ТР53 с клиникопатологическими характеристиками РМЖ.

Целью настоящего исследования явилось изучение спектра мутирования гена ТР53 при РМЖ и его связи с особенностями клинического течения заболевания.

Материал и методы

Образцы опухолей (n=60) были получены во время операции от больных РМЖ в возрасте от 29 до 76 лет (средний возраст 51,6 ± 11,2 года), получавших комбинированное лечение в клинике НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН, и хранились в замороженном состоянии при –80 0С. Диагноз был верифицирован морфологически. Стадия процесса устанавливалась согласно классификации TNM (4-е издание, 1989), в исследование включены больные со стадиями T1–4N0–2M0–1. Работа проводилась с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с «Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан» (Указ Президента РФ от 24.12.93 № 2288), было получено разрешение локального этического комитета НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН.

Выделение ДНК проводили из лейкоцитов периферической крови (эти образцы использовались как контрольные пробы в SSCP-анализе) и образцов опухоли с помощью протеиназы K и фенол-хлороформной экстракции. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили с целью амплификации участков 5, 7 и 8-го экзонов (соматические мутации) гена TP53 по стандартной методике с собственными модификациями. Последовательность используемых праймеров приведена в табл. 1. Реакционная смесь ПЦР объемом 30 мкл содержала ПЦР буфер (160 мМ (NH₄)₂SO₄, 670 мМ Трис-HCI, 15 мМ MgCI₂, 0,1 % Tween-20), 3,5 мМ MgCl₂, 0,2 мМ каждого из четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов,

Последовательности праймеров

Таблица 1

Экзон	Праймеры	Температура отжига, ºС	Ссылка
5	F 5’–GCT GCC GTG TTC CAG TTG CTT TAT C–3’ R 5’–AGG GGC CAG ACC TAA GAG CAA TCA G–3’	61	[1]
7	F 5’–AGT CTA GAG GGC CTG TGT TAT CTC CTA G–3’ R 5’–AGA GAT CTG GAG TCT TCC AGT GTG ATG AT–3’	61	[2]
8	F 5’–GCC TCT TGC TTC TCT TTT CCT ATC CTG AG–3’ R 5’–TCT GAG GCA TAA CTG CAC CCT TGG TC–3’	61	[1]

• 1    мкМ прямого и обратного праймеров, 1,5 ед. Taq-полимеразы, 50–200 нг геномной ДНК.

Для детекции мутаций в 5, 7 и 8-м экзонах гена ТР53 (область связывания белка р53 с ДНК) был использован SSCP-анализ с собственными модификациями [1, 2]. Принцип метода SSCP (от англ. Single Strand Conformation Polymorphism, полиморфизм конформаций одноцепочечных фрагментов) основан на различной электрофоретической подвижности одноцепочечных фрагментов ДНК в неденатурирующем геле, зависящей от структуры и размера исследуемого фрагмента. После ПЦР 5–10 мкл амплификата инкубировали 10 мин при 98 ºС в 1,5-кратном объеме денатурирующего буфера (на 1 мл буфера: 950 мкл формамида, 4 мкл 5М NaOH, 40 мкл 0,5М ЭДТА рН 8,0, по 0,25 мг бромфенолового синего и ксиленцианола). После прогревания пробы немедленно помещали в лед и затем наносили на полиакриламидный гель (10–12 %). Результат SSCP-электрофореза визуализировали с помощью окрашивания нитратом серебра [16].

Статистическая обработка полученных данных проводилась с помощью пакета прикладных программ «STATISTICA 6.0». Для проверки гипотезы о значимости различий между исследуемыми группами использовали непараметрический критерий согласия χ2 (Пирсона), высчитываемый в четырехпольных таблицах (при значении абсолютных частот в анализируемых ячейках больше 10). Если значение было меньше 10 и 5, то использовали критерий χ2 с поправкой Йетса либо точный критерий Фишера (F), соответственно.

Результаты и обсуждение

Исследование мутаций гена ТР53 проводили в области 5, 7 и 8-го экзонов, кодирующих цен- тральный домен связывания белка р53 с ДНК. В 61,7 % случаев (37/60) были выявлены мутации гена ТР53 в опухолях (табл. 2), что согласуется с представленными ранее результатами других авторов [8, 14, 19]. Частота мутаций ТР53 в 7-м экзоне (22,8 %; 13/57) была существенно ниже, чем в 5-м (38,3 %; 23/60) и 8-м экзонах (38,3 %; 23/60). В работах большинства авторов исследовались единичные мутации, встречающиеся в пределах одного экзона гена ТР53, хотя встречаемость множественных мутаций достаточно высока и заслуживает особого внимания при изучении их роли в прогрессии РМЖ [12, 17].

По литературным данным, частота множественных мутаций при РМЖ составляет от 5 % до 15 % [12, 17]. В нашей работе среди всех выявленных случаев мутаций частота единичных мутаций составила 48,6 % (18/37), частота множественных – 51,4 % (19/37), что выше указанных в литературе данных для РМЖ. Среди множественных мутаций «двойные» составили 84,2 % (16/19), «тройные» – 15,8 % (3/19). Большая часть двойных мутаций была представлена мутациями, затрагивающими одновременно 5-й и 8-й экзоны (62,5 %; 10/16). Все случаи наличия в гене ТР53 «тройных» мутаций (5, 7 и 8-й экзоны) были ассоциированы с неблагоприятным клиническим течением заболевания. Так, у одной пациентки был диагностирован диссеминированный злокачественный процесс, у второй – прогрессирование в виде метастазирования в мягкие ткани грудной полости через шесть лет с момента обращения. У третьей больной с тройными мутациями отмечена отягощенная наследственность по онкогинекологическим заболеваниям. Это свидетельствует о связи множественных мутаций гена ТР53 с высокой агрессивностью злокачественного процесса и плохим прогнозом. По данным литературы,

Частота мутаций гена ТР53 у больных РМЖ

Таблица 2

Результаты SSCP-анализа
Единичные мутации	Множественные мутации
Общая частота	Общая частота	Двойные				Тройные
		Общая частота	5 и 7-й экзоны	5 и 8-й экзоны	7 и 8-й экзоны	5, 7 и 8-й экзоны
48,6 %* (18/37)	51,4 %* (19/37)	84,2 %** (16/19)	12,5 % (2/16)	62,5 % (10/16)	25,0 % (4/16)	15,8 %** (3/19)

Примечание: * – частота мутаций среди индивидуумов, несущих мутации; ** – частота мутаций среди пациенток с множественными мутациями.

вопрос о природе возникновения и прогностической значимости множественных мутаций гена ТР53 остается пока без ответа. Возможно, что гипермутабильность ТР53 может проявляться на ранних этапах развития РМЖ и не связана со стадией процесса [12]. Так, было показано, что множественные мутации ТР53 детектировались в ткани РМЖ независимо от инвазивности опухоли [11]. В отношении множественных мутаций была предложена гипотеза мутационного «автостопа» (hitch-hiking), предполагающая, что при наличии патогенетически значимой мутации дополнительные мутации (миссенс или сайленс) не вносят вклад в формирование фенотипа опухоли, определяющего ее поведение [21]. Для носителей «двойных» мутаций гена ТР53 не было отмечено связи с неблагоприятным клиническим течением РМЖ.

Мы не выявили значимой ассоциации мутаций ТР53 в изучаемых экзонах с такими характеристиками процесса, как размер опухоли и степень ее злокачественности. При оценке распределения мутаций изучаемых участков гена ТР53 (5, 7 и 8-й экзоны) у больных РМЖ в зависимости от вовлеченности лимфоузлов в опухолевый процесс установлено, что в группе больных РМЖ с местно-распространенным процессом (N1–2) по сравнению с пациентками с локализованным процессом (N0) отмечается тенденция к увеличению частоты мутаций ТР53 в 5-м экзоне (53,1 % против 23,8 %; χ2=3,36, p=0,06). Ассоциация мутаций в 5-м экзоне гена ТР53 с метастазированием в регионарные лимфоузлы косвенно свидетельствует о том, что опухолевые клетки с данным типом аберраций обладают селективным преимуществом при распространении опухоли за пределы первичного очага (табл. 3). В отношении мутаций в 7-м и 8-м экзонах такой закономерности показано не было. Эти данные позволили на более представительной выборке подтвердить полученные нами ранее результаты для больных РМЖ [4]. Кроме того, нами были опубликованы данные о том, что мутации гена ТР53 в 5-м экзоне коррелируют с неблагоприятным исходом заболевания также у больных с опухолями головы и шеи [3].

Таким образом, проведено исследование наличия мутаций гена ТР53 в опухолевых клетках у больных РМЖ. Обнаруженная частота мута-

Таблица 3

Лимфогенная распространенность РМЖ	5-й экзон		7-й экзон		8-й экзон
	Норма	Мутации	Норма	Мутации	Норма	Мутации
N0	76,2 % (16/21)	23,8 % (5/21)	75 % (15/20)	25 % (5/20)	66,7 % (14/21)	33,3 % (7/21)
N1–2	46,9 % (15/32)	53,1 % (17/32) χ2=3,36 p=0,06	80,6 % (25/31)	19,4 % (6/31)	65,6 % (21/32)	34,4 % (11/32)

Распределение мутаций гена ТР53 у больных РМЖ в зависимости от лимфогенного метастазирования

ций ТР53 (61,7 %) согласуется с литературными данными. В группе больных РМЖ выявлена высокая частота множественных мутаций ТР53 , а также ассоциация мутаций в 5-м экзоне с лимфогенным распространением опухоли.

В заключение следует отметить, что мутации в различных структурных и функциональных доменах р53 по-разному отражаются на его биологической активности и, соответственно, по-разному влияют на опухолевый фенотип, определяющий агрессивность злокачественного процесса. Существующая противоречивость литературных данных о прогностической значимости мутаций р53 может быть в определенной степени объяснена использованием различных методов оценки мутационного статуса р53. В частности, иммуногистохимическая детекция аберраций белка р53 обладает достаточно низкой чувствительностью (65 %) в отношении определения генетических мутаций, тогда как метод SSCP, использующийся в нашей работе, более чувствителен – 85–90 %, и лишь в единичных работах применялся метод прямого сиквенса, выявляющий истинные нарушения в структуре ДНК [14]. Систематизация данных о связи определенных типов мутаций р53 с изменениями белка и о вкладе этих нарушений в опухолевую прогрессию может прояснить значимость мутаций р53 в прогнозе заболевания.

Работа поддержана грантом Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию (№06/1127 от 04.09.07).