Набор диагностикумов для иммуноферментной индикации антител против хламидий у крупного рогатого скота

Иммуноферментный анализ отличается высокой специфичностью, превышающую в несколько раз рутинные методы диагностики инфекционных болезней. Особенно это заметно при выявлении антител, в ИФА они определяются в первые 2-3 дня и отслеживаются в организме на протяжении 10-12 месяцев после взаимодействия с антигеном.

К преимуществам ИФА относят также: экспрессность, возможность исследовать антикомплементарные сыворотки, воспроизводимость, простота постановки реакции и учета ее результатов, стабильность регентов при хранении, автоматизация некоторых операций и т.д.

Хламидийные инфекции часто протекают в виде стертых, латентных, смешанных и вторичных инфекций, что в значительной степени затрудняет правильную оценку эпизоотической ситуации. В связи с этим при диагностике хламидиозов широко используют серологические методы, главным образом, РСК. В настоящее время применение иммуноферментного метода ветеринарными специалистами во многом сдерживается отсутствием в достаточном количестве необходимых компонентов (тест-систем и оборудования).

Учитывая это, нами была предпринята попытка использовать ИФА для серологических исследований подозрительного по заболеванию хламидиозом крупного рогатого скота.

При конструировании наборов для диагностики инфекционных заболеваний в ИФА главным моментом является подготовка антигена. Он должен хорошо адсорбироваться на твердой фазе (полистирол и др.), с высокой чувствительностью выявлять антитела и не вызывать ложноположительных реакций. Для этого в первую очередь необходимо максимально очистить микроорганизмы от питательной среды (бактерии) или клеточного дебриса (вирусы). В ИФА могут быть использованы как корпускулярные, так и некорпускулярные антигены. Для разрушения микробных клеток используют обработку детергентами (тритон Х-100, додецилсульфат и дезоксихолат натрия и т.п.), ультразвук, автоклавирование и др.

В реакции могут быть использованы как корпускулярные, так и некорпускулярные антигены. По литературным данным известно, что корпускулярные антигены весьма неэффективны для иммуноферментной индикации хламидийных антител, поэтому мы заранее отказались от их испытания в нашей работе.

Для сравнения в ИФА нами были получены и испытаны лизатные антигены хламидий. В качестве детергентов использовали: 0,1%-ный додецилсульфат натрия, 1%-ный дезоксихолат натрия, 1%-ный твин-80 и 1%-ный тритон-Х100. Исходным материалом для изготовления антигена служила очищенная и сконцентрированная хламидиосодержащая взвесь, которую предварительно инактивировали прогреванием при 600С в водяной бане в течение 120 минут. Затем суспензию обрабатывали на ультразвуковом дезинтеграторе (УЗДИ-А) на среднем режиме интенсивности озвучивания в течение 20 секунд. Обработанную ультразвуком суспензию “осветляли” на центрифуге ОС-6 М, в угловом роторе в течение 10 минут при 3500 об/минуту. Полученный надосадок «продавливали» через 20%-ный раствор сахарозы.

Очищенную суспензию обрабатывали указанными выше детергентами и ультразвуком в различных сочетаниях. Всего было испытано 5 вариантов обработки антигена хламидий. От детергентов и обломков клеток освобождались 3-х кратным переосаждением суспензии насыщенным раствором сульфата аммония. Надосадок, содержащий антиген Ch. psittaci, служил исходным материалом для дальнейших процедур очистки, которую проводили путем ультрацентрифугирования при 100000g в течение 6,5 часов в градиенте плотности сахарозы 5-55% (w/v) с шагом 5%. Было получено по 11 фракций каждого варианта обработки хламидийной биомассы, из которых были изготовлены антигены для испытания в ИФА с положительными и отрицательными сыворотками крупного рогатого скота.

Наиболее специфичным оказался антиген, полученный из фракции собранной в 35%-ной сахарозе ступенчатого градиента, после центрифугирования взвеси хламидий, которая подвергалась обработке ультразвуком и 1%-ным дезоксихолатом натрия. Коэффициент его специфичности при концентрации антигена 6 мкг/мл составил 10,8.

При проверке полученного в идентичных условиях контрольного антигена из интактных желточных мешков куриных эмбрионов было установлено, что положительные и отрицательные контрольные сыворотки с ним не реагируют.

Специфический антиген не реагировал с гетерологичными сыворотками, содержащими антитела против возбудителей микоплазм и бруцелл.

Разработанная тест система была использована для исследования сывороток крови, полученных от подозрительных по заболеванию хламидиозом крупного рогатого скота. Испытано более 400 проб, 28,2% из них были оценены как положительно реагирующие с хламидийным антигеном. При этом в ИФА отдельные “полевые” сыворотки реагировали в титре 1:2560, что говорит о его высокой чувствительности метода.

Эти же пробы были испытаны в РСК: положительно и сомнительно реагирующие сыворотки составили 4,6%. Значение показателя "РСК отрицательно / ИФА положительно", равное 23,6%, говорит о более высокой чувствительности последнего.

Таким образом, наши исследования позволили подобрать эффективные режимы очистки и лизиса антигенов хламидий при конструировании иммуноферментной тест-системы для индикации антител у крупного рогатого скота.

НАБОР ДИАГНОСТИКУМОВ ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ ИНДИКАЦИИ АНТИТЕЛ ПРОТИВ ХЛАМИДИЙ У КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

Банзузи Б.А.С., Равилов Р.Х., Герасимов В.В.

Резюме

Подобраны эффективные режимы очистки и лизиса антигенов хламидий при конструировании иммуноферментной тест-системы для индикации антител у крупного рогатого скота.

THE DIAGNOSTICUM SET FOR ENZYME IMMUNOASSAY DISPLAY OF ANTIBODIES AGAINST CHLAMYDIA IN CATTLE

Banzouzi B.A.S., Ravilov R.Kh., Gerasimov V.V.