Направленное культивирование Chlorella sorokiniana с целью увеличения синтеза каротиноидов

Микроводоросль Сhlorella sorokiniana – перспективный продуцент ценных компонентов, успешно культивируемый в лабораторных и производственных условиях [1]. В биомассе С. sorokiniana обнаружено высокое содержание ценных компонентов: белков, углеводов, липидов и биологически активных веществ [2].

Содержание пластидных пигментов, хлорофиллов и каротиноидов (3,5% в сухой биомассе) превышает содержание их у наземных растений. Известно, что хлорофиллы и каротиноиды обладают антиоксидантными свойствами [3]. Поэтому биомассу Chlorella можно использовать в получении концентратов пигментного комплекса для пищевого производства.

Ряд факторов, влияющих на обмен веществ (в том числе каротиногенез) в клетках микроводорослей в период культивирования, позволяют увеличить синтез метаболитов, что является основой направленного культивирования.

Дозированное ультрафиолетовое излучение (УФ), по мнению ряда авторов, может оказывать и стимулирующее, и угнетающее влияние [4]. Малые дозы УФ в сочетании с фотосинтетически активной радиацией (ФАР) во время роста популяции клеток С. sorokiniana могут активизировать компенсаторные фотозащитные механизмы автотрофных одноклеточных водорослей, что предполагает интенсивный синтез каротиноидов [4].

Цель работы – описание влияния дозированного УФ-излучения на процесс культивирования одноклеточных водорослей С. sorokiniana , морфофизиологическое состояние популяции микроводорослей и содержание каротиноидов в полученной биомассе.

Материалы и методы

Для исследования использовали С. sorokiniana (штамм 211–8k) из коллекции водорослей университета Гёттингена (Culture Collection of Algae at Göttingen University, international acronym SAG). Культивирование проводили в лабораторном биореакторе цилиндрической формы объемом 0,5 л [5, 6] c использованием универсальной питательной среды, содержащей все необходимые макро- и микроэлементы [7].

Перемешивание осуществляли барботированием воздухом с помощью компрессора Хilon AP-001, в режиме 1,5 л/мин. Температурный диапазон культивирования 20–23 °С. Режимы освещенности «день-ночь» (16–8 ч.):

• •    вариант 1 – контроль, лампа дневного света (ФАР), интенсивность – 2500±200 Лк, Т(К) – 400;

• •    вариант 2 – УФ1, периодическое УФ-облучение в течение 15 мин в сутки ртутной газоразрядной лампой со спектральной областью светового потока 280–315 нм (УФ-В), интенсивность 1300 Лк. Дальнейшее освещение лампой дневного света (интенсивность – 2500±200 Лк, Т(К) – 400);

• •    вариант 3 – УФ2, освещенность лампой дневного света (интенсивность – 2500±200 Лк, Т(К) – 400),

  ультрафиолетовое облучение в течение 30 мин (со спектральной областью светового потока 280–315 нм (УФ-В), интенсивность 1300 Лк) на завершающей фазе культивирования (стабилизации).

Рисунок 1. Лабораторный фотобиореактор для культивирования микроводоросли С. sorokiniana : 1 – насос-аэратор; 2 – трубка подачи воздуха; 3 – лампа дневного света; 4 – источник УФ-излучения Figure 1. Laboratory photobioreactor for the cultivation of microalgae C. sorokiniana : 1 – pump-aerator; 2 – air supply tube; 3 – fluorescent lamp; 4 – UV radiation source

Культивирование проводили в двукратной повторности. Для определения концентрации клеток в суспензии во время культивирования водорослей была найдена линейная зависимость между значениями оптической плотности (при 750 нм, в кювете сравнения – питательная среда) и концентрацией клеток в суспензии. Концентрация клеток в суспензии была определена с помощью камеры Горяева, а оптическая плотность – на спектрофотометре Юнико 1201.

Для определения выхода сухой биомассы отделение жидкой фазы от биомассы проводили центрифугированием в режиме 5000 мин ^-1 в течение 5 мин. с дальнейшим декантированием надосадочной жидкости. Биомасса в дальнейшем высушивалась на воздухе при 20–23 °С в темном месте. Содержание влаги в воздушно-сухой биомассе не превышало 2%.

Микроскопирование прижизненных препаратов суспензии микроводорослей проводили с помощью микроскопа МИКМЕД-6 с системой визуализации (АО «ЛОМО», Санкт-Петербург). Для обработки микрофотографий использовали программу микроанализ FOTO (АО «ЛОМО», Санкт-Петербург) и Levenguk (производитель «Levenhuk LabZZ»).

Для количественного анализа пигментов (хлорофиллов и каротиноидов) в экстрактах биомассы использовали полосы поглощения пигментов в области 440, 649 и 664 нм и методику авторов [8, 9]. Характеристики состава пигментного комплекса в полученных экстрактах определяли по сумме пигментов и содержанию хлорофиллов и каротиноидов, соотношению хлорофиллов а и b .

Результаты и обсуждение

На начало культивирования концентрация клеток в культуральной среде – 4,6 млн кл./мл (рисунок 2). Лаг-фаза не выражена или составляет не более 1 сут во всех вариантах эксперимента.

Сутки Day

♦контроль ‘УФ1 «УФ2

. control * UV1 . UV2

Рисунок 2. Кривые культивирования С. sorokiniana в различных условиях освещенности: контроль – освещение лампами дневного света; УФ1 – периодическое воздействие ультрафиолетовым излучением; УФ2 – воздействие ультрафиолетом в фазу стабилизации

Figure 2. Curves of cultivation of C. sorokiniana in various lighting conditions: control – fluorescent lighting; UV1 – periodic exposure to ultraviolet radiation; UV2 – exposure to ultraviolet light in the depletion phase)

В контрольном и УФ2 вариантах фаза интенсивного роста составляет 10–11 сут, и сокращена до 8–9 сут в варианте УФ1. Отмечено изменение цвета суспензии водорослей в фазе стабилизации в варианте УФ2, она приобретает желтый оттенок.

На рисунке 3 изображен выход сухой биомассы, полученной в ходе культивирования при разных условиях освещенности.

C. sorokiniana , полученной при культивировании в различных условиях освещенности: УФ1 – периодическое ультрафиолетовое воздействие; УФ2 – воздействие ультрафиолетом в фазу стабилизации Figure 3. The yield of air-dry biomass obtained during cultivation under various lighting conditions: UV1 – periodic ultraviolet exposure; UV2 – exposure to ultraviolet in the stabilization phase

При однократном воздействии УФ-облучения (вариант УФ2) выход биомассы достоверно не отличается от контрольного варианта, а при периодическом УФ-облучении (вариант УФ1) приводит к существенному снижению выхода биомассы в среднем на 48%. Анализ кривой культивирования показал, что уменьшение содержания биомассы происходит в заключительную фазу культивирования после 9 сут.

На рисунке 4 представлен спектр поглощения пигментного комплекса, экстрагированного 96%-ным этанолом (ГОСТ 5962–2013). При анализе спектров поглощения отмечено две полосы поглощения в сине-фиолетовой области 380–500 нм и в красной области 640–670 нм. Пики при 420 (1) и 664 нм (5) соответствуют хлорофиллу а [10]. Хлорофиллу b соответствуют пики 453, 649 нм, плечо (4) при 420 нм описано для протохлорофилла [11]. Для каротиноидов отмечена полоса поглощения в области 420–480 нм, пики 440,5 (2) и 470 нм (3) описаны для каротиноидов.

Рисунок 4. Спектр поглощения этанольных экстрактов пигментов из воздушно-сухой биомассы C. sorokiniana , полученной при культивировании в различных условиях освещенности: контроль; УФ1 – периодическое ультрафиолетовое воздействие; УФ2 – воздействие ультрафиолетом в фазу стабилизации Figure 4. Absorption spectrum of ethanol extracts of pigments from air-dry biomass C. sorokiniana obtained by cultivation under various lighting conditions: control; UV1 – periodic ultraviolet exposure; UV2 – exposure to ultraviolet light in the stabilization phase.

В таблице 1 представлены данные по содержанию пластидных пигментов в воздушносухой биомассе полученных образцов в различных условиях освещенности при культивировании микроводорослей C. sorokiniana .

Наибольшее содержание суммы пигментов отмечено для контрольного варианта, в вариантах с УФ-облучением отмечено уменьшение содержания суммы пигментов в среднем на 26,9% (вариант УФ1) и на 8,5% (вариант УФ2). В вариантах с УФ-облучением отмечено наиболее существенное снижение содержания вспомогательного хлорофилла b , соответственно увеличивалось соотношение Ch a / Ch b .

Таблица 1.

Содержание пластидных пигментов в образцах воздушно-сухой биомассы C. sorokiniana

Table 1.

Plastid pigment content in air-dried biomass samples of C. sorokiniana

Содержание пигментов, мг/г сухой биомассы The pigment content, mg/g dry biomass	Образцы биомассы, полученные в различных условиях культивирования Biomass samples obtained under various cultivation conditions
	Контроль Control	УФ 1 UV 1	УФ 2 UV 2
Хлорофилл а | Chlorophyll a	14,78±0,21	9,94±0,23 **	13,89±0,45**
Хлорофилл b | Chlorophyll b	7,73±0,17	4,13±0,11 **	6,79±0,35**
Сумма каротиноидов | Sum of carotenoids	4,24±0,14	5,49±0,10 **	3,80±0,12**
Сумма пигментов | Pigment amount	26,76±0,31	19,56±0,37**	24,48±0,85**
Доля каротиноидов от суммы пигментов, % The proportion of carotenoids from the amount of pigments, %	15,84±0,44	28,10±0,37**	15,60±0,42**
Соотношение хлорофиллов а / b The ratio of chlorophyll a / b	1,92±0,05	2,42±0,05**	2,06±0,05

Примечание: УФ1 – периодическое ультрафиолетовое воздействие; УФ2 – воздействие ультрафиолетом в фазу стабилизации, ** – достоверные отличия при уровне вероятности 0,99.

Note: UV1 – periodic ultraviolet exposure; UV2 – exposure to ultraviolet light in the stabilization phase, ** – significant differences at a probability level of 0.99.

Длительное УФ-облучение вызывает фотоповреждение белков и фосфолипидов плазматических мембран: окисление липидов мембран по свободнорадикальному механизму с образованием гидропероксидов с последующим их фотохимическим расщеплением и получением стабильных конечных продуктов. Ранее было показано, что влияние острых доз УФ-излучения на клетки водорослей сопровождается повышением уровня защитной антиоксидантной активности водорослей [12].

В большинстве случаев фотоповреждения являются следствием генерации избытка три-плетно возбужденного Хл, способного взаимодействовать с О 2 – продуктом оксигенного фотосинтеза. В результате образуются химически реактивные формы синглетного О2. Фотопро-текторная роль Хл зависит от функции ПБК. Другой способ заключается в эффективном переносе энергии от триплетно возбужденного Хл на каротиноиды, которые рассеивают энергию в виде тепла [3].

Каротиноиды в ряде случаев являются важным структурным элементом трансмембранных комплексов, которые наряду с другими компонентами обеспечивают стабильность их структуры и эффективное выполнение комплексами их основной функции при фотосинтезе [14].

Фотозащитная функция каротиноидов связана со способностью их гасить энергию возбуждения электрона за счет делокализации электрона сопряженной системой связей [14].

Периодическое УФ-облучение приводит к усилению каротиногенеза. В биомассе возрастало содержание суммы каротиноидов по сравнению с контролем в среднем на 29,5%, при более длительном однократном воздействии УФ-облучения в фазу стабилизации наблюдается уменьшение содержания суммы каротиноидов в среднем на 10,4%.

На рисунке 5 представлена микроскопическая картина популяции клеток C. sorokiniana в фазу стабилизации, полученных при периодическом (УФ1) и однократном длительном УФ-облучении (УФ2).

При исследовании прижизненных препаратов (в 10 полях зрения) в вариантах УФ1 (рисунок 5 b) и УФ2 (рисунок 5 c) отмечали появление обесцвеченных клеток с большой вакуолью и ядром с конденсированным хроматином, морфологически измененные клетки были крупнее остальных. Также отмечали образование флоков, способствующих седиментации клеток.

По литературным данным появление морфологически измененных клеток с крупными вакуолями, разрушенным хлорофиллом характерно для клеток при воздействии температурного и осмотического стрессового фактора, а также при УФ-облучении, что характерно для апоптоза [15, 16].

а                                    b                                    с

Рисунок 5. Микроскопическая картина популяций C. sorokiniana в фазу стабилизации, полученных в разных условиях культивирования: a – контроль; b – периодическое ультрафиолетовое воздействие; с – воздействие ультрафиолетом в фазу стабилизации

Figure 5. Microscopic picture of C. sorokiniana populations in the stabilization phase obtained under different cultivation conditions: a – control; b – periodic ultraviolet exposure; c – exposure to ultraviolet light in the stabilization phase

Заключение

Таким образом, при периодическом УФ-облучении наблюдается снижение количества клеток водорослей в суспензии на 9-е сут, соответственно и выход биомассы существенно снижается по сравнению с контролем. Однократное УФ-облучение в течение 30 мин приводит к незначительному снижению выхода воздушносухой биомассы, что при дальнейшем росте популяции может быть скомпенсировано.

Периодическое УФ-облучение приводит к активации каротиногенеза, выход суммы каротиноидов в пересчете на сухую биомассу превышает контрольный вариант в среднем на 30%.

Однократное ультрафиолетовое облучение в течение 30 мин в фазу стабилизации приводит к снижению содержания в биомассе как хлорофилла, так и каротиноидов.

Микроскопическое исследование популяций микроводоросли показало, что УФ-облучение приводит к появлению клеток с признаками апоптоза: крупные клетки с большими вакуолями, конденсированным ядром, обесцвеченным хлоропластом.

Дальнейшим направлением исследования является подбор условий, позволяющих увеличить выход каротиноидов при минимальных потерях биомассы микроводорослей.