Нарушение репродуктивного потенциала самцов белых крыс при воздействии дыма природного пожара

На современном этапе особую актуальность приобретает проблема неуклонного снижения показателей мужской фертильности [Rolland et al., 2013], обусловленная влиянием множества факторов, особое место среди которых занимают негативное воздействие окружающей среды и различные факторы образа жизни [Kulikauskas, Blaustein, Ablin, 1985; Kiziler et al., 2007].

Продолжительные и масштабные природные пожары являются мощными источниками выброса в атмосферный воздух многокомпонентной смеси твердых частиц и газов, значительная часть из которых являются канцерогенными, генотоксичными или мутагенными, что обосновывает необходимость изучения токсического воздействия дыма природных пожаров на мужскую репродуктивную функцию. Несмотря на то, что последствия лесных и торфяных пожаров в последнее время приобрели мировой масштаб, данный аспект токсического воздействия дыма природных пожаров в современной литературе освещен недостаточно. Много- численные клинические и экспериментальные исследования посвящены изучению взаимосвязи уровня загрязнения атмосферного воздуха твердыми частицами (PM2,5) и показателями функционального состояния мужской репродуктивной системы [Hansen et al., 2010; Deng et al., 2016; Radwan et al., 2016; Chen et al., 2019; Huang et al., 2019], которые свидетельствуют об усилении митохондриальной дисфункции и повышения уровня фрагментации ДНК сперматозоидов.

Особый интерес представляют исследования, направленные на оценку воздействия табачного дыма на мужской репродуктивный потенциал. Так, эпидемиологические исследования убедительно доказывают, что курение изменяет уровень метилирования ДНК и экспрессию генов в клетках периферической крови, клетках буккального эпителия и легочной ткани у лиц, подвергавшихся воздействию табачного дыма [Kohli et al., 2012; Bosse et al., 2012; Ambatipudi et al., 2016]. В исследованиях T.G. Jenkins с соавторами показано, что у курящих мужчин выявлено изменение метилирования ДНК сперматозоидов [Jenkins et al., 2017].

Использование экспериментальных моделей дает широкие возможности для исследования механизмов развития патологии репродуктивной системы при экспозиции дымом природных пожаров, условия которой могут варьировать в широких пределах. Ранее нами была разработана экспериментальная модель низового ландшафтного пожара, в процессе которого длительное время горят лесная подстилка, валежник и гнилые пни с выделением сильного дыма, при этом основным является беспламенное горение [Вокина и др., 2019]. Основным критерием достижения необходимого уровня загрязнения воздушной среды являлось содержание в воздухе экспозиционной камеры оксида углерода (СО). Согласно данным инструментальных замеров в некоторых городах РФ во время задымления от природных пожаров уровень СО составлял 3.6‒30 мг/м3 [Air quality …, 2010; Звягинцев и др., 2011; Панов и др., 2018]. Цель исследования – оценка показателей репродуктивного потенциала самцов белых крыс, подвергавшихся воздействию дыма.

Материал и методы исследования

Опыты поставлены на 20 беспородных белых крысах-самцах, массой 180‒240 г. Все экспериментальные животные получены путем собственного воспроизводства в виварии ФГБНУ Восточно-Сибирского института медико-экологических исследований и содержались на стандартном рационе. Работа выполнена с соблюдением правил гуманного отношения к животным в соответствии с требованиями «Международных рекомендаций по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (ВОЗ, Женева, 1985) и «Правилами лабораторной практики» (Приказ Минздравсоцразвития России от 23 августа 2010 г., № 708н).

Животных опытных групп (n = 10) подвергали динамическому ингаляционному воздействию дыма в затравочных камерах объемом 200 л, 4 ч. в день, 5 дней в неделю, в течение 4 недель [Вокина и др., 2019]. Крысам контрольной группы (n = 10) в камеру подавался чистый воздух. Средние концентрации оксида углерода и РМ2,5 в экспозиционной камере составили 28.7±5.3 мг/м3 и 1.9±0.5 мг/м3, соответственно. Температуру воздуха в экспозиционных камерах поддерживали на уровне +24…+25ºС, относительную влажность 40–50%.

Сразу после окончания воздействия половину животных контрольной и опытной групп умерщвляли путем декапитации под легким эфирным наркозом для проведения исследования морфофункционального состояния репродуктивной системы и анализа уровня фрагментации и метилирования ДНК в ткани семенников и крови. По общепринятой методике производился забор гисто- логического материала (ткань семенников), их фиксация в 15%-ном растворе нейтрального формалина. После гистологической проводки материал заливали в парафин. Срезы толщиной 6–7 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. При обзорной микроскопии изучали следующие морфометрические параметры: общее количество спер-матогоний, количества клеток Лейдига, число канальцев со слущенным эпителием. На основе количественных данных, полученных при цитологическом исследовании семенников, рассчитывали индекс сперматогенеза как отношение суммы всех подсчитанных слоев клеток в одном канальце к количеству всех просчитанных канальцев [Ухов, Астраханцев, 1983]. Исследование фрагментации ДНК проводили методом ДНК-комет [Дурнев и др., 2010]. Уровень полногеномного метилирования, являющегося одним из главных эпигенетических факторов, также оценивали методом ДНК-комет в модификации с использованием рестрик-таз MspI и с HpaII («СибЭнзим»), Россия [Wentzel et al., 2010]. Суспензии клеток (55 мкл) добавляли к 1%-ному раствору легкоплавкой агарозы (500 мкл) в фосфатно-солевой буфер (ФСБ) и наносили на предварительно покрытые 1%-ной универсальной агарозой стекла, инкубировали с покровным стеклом на льду 10 мин. После затвердевания агарозы стекла помещали в лизирующий буфер (10 мM трисHCl pH 10, 2.5 M NaCl, 100 мM ЭДТАNa2, 1% Тритон Х100, 10% DMSO) и инкубировали не менее 1 ч. при 4оС. После инкубации стекла 3 раза отмывали раствором 10 мM ЭДТА с 5%-ным DMSO в ФСБ в течение 10 мин., после чего на стекло наносили 100 мкл раствора, содержавшего 1 Ед. HpaII или 1.5 Ед. MspI с реакционным буфером («СибЭнзим», Россия), и инкубировали во влажной камере 1 ч. при 37оС. Затем проводили щелочной электрофорез в растворе (0.3М NaOH и 1мМ ЭДТА-Na, рН13) в течение 20 мин. при напряженности поля 1 В/см, затем стекла фиксировали в 70%-ном этаноле (20 мин.), высушивали и хранили при комнатной температуре. Для одного и того же исследуемого образца ДНК в опыт брали три варианта: с MspI, с HpaII и без добавления ферментов. Последний вариант служил контролем сохранности ДНК в реакционном буфере. Окраска препаратов осуществлялась SYBR GreenI, регистрацию проводили на микроскопе «OLYMPUS ВХ-52», совмещенном с цифровой камерой «OLYMPUSRХ-420» при увеличении «х100». Изображения ДНК-комет (по 100 клеток от каждого животного) анализировали с помощью программы «CASP 1.2.2». В качестве показателя поврежденности ДНК использовали процентное содержание фрагментов ДНК в хвосте комет («%ДНК в хвосте»). Для каждого стекла анализировали около 100 ядер. Уровень полногеномного метилирования рассчитывали по формуле 100 - (HpaII/MspI *100), где HpaII и MspI – средний процент ДНК в хвосте кометы в 100 ядрах на препаратах, обработанных HpaII и MspI соответственно. В качестве показателя фрагментации ДНК использовали процентное содержание фрагментов ДНК в хвосте комет («% ДНК в хвосте») без дополнительного этапа рестрикции ферментами HpaII и MspI.

Статистический анализ результатов исследования проводился с использованием пакета прикладных программ Statistiсa 6.1. (StatSoft) (лиц № AXXR004E642326FA). Для принятия решения о виде распределения признаков использовали W-критерий Шапиро-Уилка. Для сравнения групп применяли U-критерий Манна-Уитни. Нулевые гипотезы об отсутствии различий между группами отвергали при достигнутом уровне значимости р≤0.05. Результаты представлены в виде медианы и интерквартильного размаха (Me (LQ;UQ)).

Результаты и их обсуждение

По результатам морфометрического исследования основных функциональных показателей деятельности семенников белых крыс, подвергавшихся воздействию дыма, выявлено снижение индекса сперматогенеза более чем на 20% при сравнении с группой контроля (U = 21, Z = ‒2.57, p = 0.010; рис. 1). Кроме того, у самцов опытной группы наблюдалось статистически значимое снижение количества сперматогоний и клеток Лейдига (U = 13.5, Z = ‒2.53, p = 0.011 и U = 7.5, Z = ‒3.17, p = 0.001, соответственно). При оценке состояния се-мяродного эпителия на препаратах гонад у крыс-самцов опытной группы не зафиксировано существенных изменений по количеству канальцев со слущенным эпителием.

Результаты проведенного исследования показали, что исследованные образцы крови и семенников имеют разный уровень фрагментации и метилирования ДНК как в норме, так и после воздействия продуктов горения. Уровень ДНК-фрагментации в половых клетках и крови животных опытной группы не имел статистически значимых отличий по сравнению с соответствующими показателями группы контроля и составлял 0.03(0.02; 0.21)% и 3.25(2.08; 5.47)% против 0.05(0.03; 0.32)% и 3.05(1.93; 7.72)% в контроле, соответственно. Статистически значимых отличий по уровню полногеномного метилирования ДНК в ткани семенников экспонированных животных при сравнении с контрольной группой не выявлено (рис. 2). Вместе с тем выявлено статистически значимое повышение уровня полногеномного метилирования ДНК в крови самцов белых крыс, подвергавшихся воздействию дыма (U = 9, Z = 2.36, p = 0.018; рис. 2).

самцы опыт          самцы контроль ^Мин.-Макс.

Рис. 1 . Индекс сперматогенеза белых крыс при воздействии дыма лесного пожара.

* - различия статистически значимы по сравнению с контролем при р < 0.05

Рис. 2 . Уровень полногеномного метилирования ДНК в крови и половых клетках белых крыс при воздействии дыма лесного пожара.

* - различия статистически значимы по сравнению с контролем при р < 0.05

В результате проведенных экспериментальных исследований выявлено нарушение процесса сперматогенеза и изменение уровня метилирования ДНК в крови экспонированных дымом животных. Несмотря на то, что дым лесных пожаров является многокомпонентной смесью из газов и частиц с доказанными мутагенными или генотоксическими свойствами [Ewa, Danuta, 2017; Kopp, Zalko,

Audebert, 2018; Liu et al., 2018; Muthusamy, Peng, Ng, 2018], уровень повреждения ДНК в клетках крови и семенниках не имел статистически значимых отличий при сравнении с контролем. Отсутствие изменений по уровню повреждения и полногеномного метилирования ДНК в семенниках у экспериментальных животных, вероятно, связано с тем, что поступающие в организм генотоксические соединения не достигли половых желез в достаточной концентрации, в то время как их концентрация в крови оказалась достаточной для появле- ния эпигенетических модификаций. В данном случае можно говорить о сохранении активности ге-матотестикулярного барьера, играющего главную роль в снижении проникновения токсичных веществ в гонады [Miller, Cherrington, 2018].

В исследованиях S. Ambatipudi et al. [2016] показано, что воздействие табачного дыма обратимо изменяет уровень метилирования ДНК и экспрессию генов в ДНК в периферической крови. Эти данные согласуются с результатами экспериментальных исследований Tsaprouni и Zeilinger, свидетельствующих о том, что воздействие табачного дыма значительно влияет на уровень метилирования ДНК в цельной крови, причем данные изменения в значительной степени корректируются после прекращения курения [Zeilinger et al., 2013; Tsaprouni et al., 2014]. Результаты исследования Murphy с соавторами [Murphy et al., 2019] показали, что оксидативный стресс является основным фактором, влияющим на изменение уровня метилирования ДНК сперматозоидов и последующие эффекты у потомства.

Заключение

Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что длительное воздействие дыма природных пожаров на крыс-самцов приводит к нарушению процесса сперматогенеза и повышению уровня метилирования ДНК в клетках крови. Высокий окислительный потенциал твердых частиц в дыме природных пожаров [Verma et al., 2009] и присутствие в нем потенциальных газообразных генотоксикантов могут, по нашему мнению, вызывать патологические состояния, ведущие к повреждению и фрагментации ДНК, а также к апоптозу сперматозоидов. Вследствие этого возрастает вероятность риска развития нарушений здоровья у потомства отцов, подвергшихся воздействию дыма, что ставит задачу по более углубленному исследованию выявленных фактов.

Финансирование осуществлялось за счёт средств, выделяемых для выполнения государственного задания