Наследование цитогенетических и молекулярно-клеточных эффектов в клетках костного мозга животных при хроническом воздействии ионизирующего излучения

Актуальной проблемой современности является не только изучение изменения стабильности генома соматических клеток, выяснение механизмов его дестабилизации в условиях действия комплекса факторов окружающей среды, в том числе и радиационных, но и исследование возможности наследственной передачи этих изменений. К настоящему времени накоплен ряд экспериментальных и эпидемиологических данных, свидетельствующих о возможности повышения нестабильности генома у потомства облученных родителей [1, 5, 7, 10, 13, 22, 23]. Изучение состояния животных при хроническом облучении в диапазоне малых доз ионизирующей радиации (до 50 сГр) выявило неоднозначность геномного ответа [1, 10].

Цель исследования: с помощью цитогенетических и молекулярных методов изучить стабильность генома лабораторных мышей при хроническом воздействии ионизирующего излучения (ИИ) в диапазоне малых доз и их необлученных потомков, что позволит выявить возможность наследования радиационно-индуцированной нестабильности в ряду поколений этих животных.

Материалы и методы. Эксперименты были проведены на мышах линии Af, которые с двухмесячного возраста содержались в условиях хронического γ-излучения. Использована γ-уста-новка с двумя источниками ²²⁶Ra, содержащих 0,474 х 10⁶ и 0,451 х 10⁶ кБк ²²⁶Ra. Облучение животных проводили в течение от 1 до 7 месяцев при мощности экспозиционной дозы 150 мкГр/ч. Суммарные дозы облучения животных составили 10, 20, 30, 37, 45, 52 и 64 сГр, которую определяли с помощью дозиметров экспозиционной дозы ДТУ-1 на базе детекторов ДТГ-4. Для получения потомства (F 1 ) от облученных животных были использованы самцы и

самки мышей, которые подвергались облучению в течение 1, 2 и 3 мес., наколенная доза у которых составила 10, 20 и 30 сГр . От мышей, облученных в дозе 30 сГр, получены потомки до пятого поколения. Контрольные пары животных формировались одновременно с опытными парами.

Методы исследования. Изучение генетических эффектов хронического излучения на молекулярном уровне проведены на клетках костного мозга с использованием ДНК-кометного теста, который основан на электрофорезе иммобилизованных в агарозу отдельных клеток. Для анализа уровня повреждения ДНК был использован «нейтральный» вариант метода ДНК-комет, детектирующий двунитевые разрывы (ДР) ДНК [26]. Препараты анализировали на микроскопе AxioSсopе А1 (Carl Zeiss, Германия) с видеосистемой на основе цифровой камеры AxioCam с программой «AxioVision, Release 4.8.2» (Carl Zeiss). На каждом слайде регистрировали по 100 комет. Для анализа и обработки микрофотоизображений ДНК-комет использовали программу СometScore Pro. Количество дву-нитевых разрывов ДНК оценивали по количеству поврежденной ДНК в хвосте кометы, выраженной в процентах (% ТDNA) [25]. Для цитогенетических исследований использован микроядерный тест клеток костного мозга, который является одним из информативных и быстрых способов индикации генотоксичности различных факторов химической и физической природы, основанный на подсчете интерфазных клеток с микроядрами [20]. Препараты КМ для подсчета микроядер (МЯ) готовили из той же взвеси клеток, которую использовали для ДНК-кометного теста. Гипотонию проводили 0,56% раствором KCL (+370C, 10 мин) и фиксировали метанол-уксусным (3:1) фиксатором [16]. Анализ клеток проведен с использованием флуоресцентной микроскопии, что позволило оценить не только частоту клеток с микроядрами, но и митотический индекс (МИ), и долю элиминирующих клеток по типу программированной гибели - апоптозу [17]. Для учета всех типов клеток в 1000 просмотренных (интерфазных, делящихся, с микроядрами, апоптоз-ных) использован лабораторный счетчик «Стимул Плюс С5». Статистическую обработку экспериментального материала проводили с использованием критерия Стьюдента, критерия малых долей, U-критерия Манна-Уитни [11].

Результаты и обсуждение. В эксперименте с хроническим облучением было задействовано 135 животных. Результаты микроядерного теста, представленные на рис. 1, свидетельствуют о том, что у контрольных животных количество аберрантных клеток с возрастом (от 3 до 5 мес.) увеличивается от 6 до 14‰ и продолжительное время остается на одном уровне (14±2%о). У мышей, испытывающих хроническое облучение, отмечены периоды резкого увеличения и уменьшения количества клеток с микроядрами (от 5,2 до16,2%о), что достоверно выше (при дозе 20 сГр) или ниже (при дозах 30, 37 и 64 сГр) физиологической нормы. То есть у животных в условиях хронического низкодозового воздействия ионизирующего излучения мы наблюдаем немонотонное изменение количества повреждений ДНК, которое свидетельствует о гиперчувствительности при меньших дозах (20 сГр) и радиорезистентности при более высоких дозах (30, 37 и 64 сГр).

Оценка количества двунитевых разрывов ДНК у животных, облученных в дозах 10, 20 и 30 сГр проведена через 4 месяца после окончания облучения (животные использовались для получения потомства). Сравнение количества поврежденной ДНК (в процентах, % TDNA), содержащейся в «хвосте» кометы, показало, что у животных, облученных в дозах 10 и 20 сГр, различий с контролем по количеству ДР не обнаружено (табл. 1). Животные, облученные в большей дозе (30 сГр), имели достоверно меньше ДР, чем контрольные. Сравнение ранжированных данных (табл. 1) по процентному содержанию ДНК в хвосте кометы показало, что у животных, облученных в дозе 10 сГр, по сравнению с контролем понижено количество клеток с неповрежденной ДНК (р<0,001), а у облученных в дозе 30 сГр этот показатель достоверно выше, чем в контроле (5,6 и 2,1%, соответственно, р<0,01). Таким образом снижение количества ДР ДНК у животных облученных в дозе 30 сГр связано с достоверно более высоким содержанием неповрежденных клее-ток (рис. 4), что может свидетельствовать об активации систем репарации ДНК. У мышей, подвергнутых облучению в дозах 10 и 20 сГр, меньше клеток с большим количеством поврежденной ДНК (>50%): у облученных в дозе 20 сГр различие с контролем достоверно (р<0,001), у облученных в дозе 10 сГр -имеет только тенденцию (р=0,06). Клетки с большой долей поврежденной ДНК относят к апоптозным [10, 17]. Поэтому можно предположить, что снижение количества клеток с высокофрагменти-рованной ДНК связано со снижением чувствительности клеток к апоптозу. Несмотря на отсутствие отличий по средним значениям ДР ДНК у животных, облученных в дозах 10 и 20 сГр, по сравнению с контролем, мы наблюдаем различия по уровню клеток с неповрежденной и высоко фрагментированной ДНК.

микронуклеированных клеток костного мозга в зависимости от дозы Y-излучения и возраста лабораторных мышей.* - различия с контролем достоверны при р^ 0,05

Таблица 1. Уровень двунитевых разрывов ДНК по результатам ДНК-кометного теста клеток костного мозга мышей линии Af, подвергнутых хроническому облучению в разных дозах, и их необлученных потомков

Покол ения	Варианты облучения	N	% TDNA	Клетки с неповрежд енной ДНК, %	Клетки с высоко-фрагментир ованной (>50%) ДНК, %
Fо	0	10	23,3±0,3	2,1±0,3	1,7±0,3
	10 сГр	5	24,6±0,4	0,4±0,2***	0,7±0,4
	20 сГр	6	23,2±0,4	1,4±0,5	0,5±0,3***
	30 сГр	6	19,6±0,5*	5,6±1,0**	1,2±0,5
F 1	0	5	15,6±0,6	10,2±1,6	1,9±0,07
	10 сГр	9	19,3±0,4*	1,0±0,3**	2,1±0,04*
	20 сГр	8	24,7±0,8*	1,2±0,3***	10,9±0,9***
	30 сГр	9	25,6±0,5*	2,1±0,5***	4,6±0,7*

Примечание : * - достоверность отличий от контроля (0) при p<0,05; ** - p<0,01; *** -p<0,001.

Митотическая активность клеток костного мозга контрольных животных с возрастом увеличилась от 1,0 до 4,8%о, а к 8-9 мес. снизилась до 3^ (рис. 2), что соответствует физиологической норме возрастного изменения пролиферативной активности. У мышей, подвергнутых хроническому низкодозовому облучению, данный показатель имел фазовый характер изменений (отмечено два пика и два минимума митотической активности), и амплитуда колебаний была больше, чем у животных из контрольной группы - от 0,8 до 5,4%о. Отметим, что достоверное повышение митотического индекса (в точке 20 сГр) сопровождается увеличением количества клеток с микроядрами, а при снижении этого показателя в точках 37 и 64 сГр наблюдается достоверное снижение доли клеток с МЯ (рис. 1). Снижение пролиферации связывают с остановкой клеточного цикла, необходимой для успешной репарации ДНК и активацией систем контрольных точек клеточного цикла (сверочных точек) [6]. Замедление деления клеток способствует увеличению времени, необходимому для репарации хромосомных аберраций, что в последующем приводит к снижению повреждений ДНК, зарегистрированных нами на клеточном (снижение клеток с микроядрами в точках 37 сГр и 64 сГр) и молекулярном (ДР ДНК) уровнях. То есть, исследуемые показатели - частота клеток с МЯ и митотический индекс клеток костного мозга у облучаемых животных в течение времени резко меняют свои величины вплоть до изменения знака биологического эффекта малых доз ИИ. Это указывает на отсутствие линейной зависимости между дозой хронического низкодозового облучения и его эффектом в клетках костного мозга. Наблюдаемые эффекты свидетельствуют об изменении чувствительности животных в процессе облучения, которая меняется от гиперчувствительности (достоверное повышение частоты МЯ, точка 20 сГр), до радиорезистентности (достоверно более низкая частота клеток с МЯ при дозах 30, 37, и 64 сГр, достоверно более низкий уровень ДР ДНК при дозе 30 сГр).

К настоящему времени известно, что при «слабых» радиационных воздействиях может происходить не только повышение, но и снижение выхода генетических нарушений [4, 18, 19]. Подобные эффекты малых доз ИИ отмечены в натурных исследованиях и экспериментах на разных объектах -клеточных культурах, млекопитающих, у работников атомной промышленности, у пострадавших от инцидентов на объектах ядерной промышленности. В работе [12] отмечено, что у сотрудников Сибирского химического комбината, которые в процессе профессиональной деятельности подвергались хроническому радиационному воздействию, дозовая зависимость частоты хромосомных аберраций (ХА) имела нелинейный характер. При облучении в дозе до 10 мЗв наблюдали достоверное уменьшение частоты ХА по сравнению с контролем, что соответствует известному явлению радиационного гормезиса. Проявление волнообразных изменений генетических эффектов у животных (кур), испытавших воздействие хронического облучения в течение 30 сут., отмечены в работе В.А. Будакова [2]. Установлено, что воспроизводительная способность после введения курам 131I в количестве 0,11 МБк/кг существенно не изменялась, при воздействии 1,1 МБк/кг - повышалась, при 2,1 МБк/кг - после кратковременного повышения отмечено снижение, при 4,6 МБк/кг - угнетение вплоть до необратимого прекращения. Снижение выраженности радиационного эффекта и изменение знака эффекта малых доз ИИ может быть связано с изменением в системе защиты генома - повышение эффективности системы детоксикации свободных радикалов, активации процессов репарации ДНК, апоптоза клеток [3, 6,9].

Проявление радиационно-индуцированных эффектов у потомков облученных животных. Анализ клеток костного мозга показал, что у потомков F 1 , родителей облученных в дозах 10, 20 и 30 сГр, доля клеток с МЯ достоверно выше контроля (рис. 3).

Рис. 2. Изменение митотической активности клеток костного мозга при хроническом низкодозовом облучении лабораторных мышей. * - различия с контролем достоверны при р^ 0,05

Рис. 3. Результаты исследования эффектов нестабильности генома клеток костного мозга потомков F 1 животных, испытавших воздействие хронического Y-излучения в разных дозах

Более выраженный эффект в отношении нестабильности генома в условиях проведенного эксперимента прослежен у потомков родителей, облученных в меньших дозах (10 и 20 сГр): частота клеток с МЯ в костном мозге в этих группах превышала норму в 2 раза (р<0,01), у потомков родителей, получивших дозу 30 сГр - в 1,3 раза (р<0,05). Исследования на молекулярном уровне показали, что у всех потомков F1 облученных животных наблюдается достоверно более высокий уровень ДР ДНК (рис. 3). По сравнению с контролем у F1 облученных животных происходит снижение в 5-10 раз количества клеток с неповрежденной ДНК и повышение в 2-4 раза клеток с высоко фрагментированной ДНК (табл. 1). Следует отметить, что у потомства облученных родителей в дозах 10 и 20 сГр наблюдается достоверное снижение МИ, что может свидетельствовать об активации репарации ДНК (рис. 3). У первого поколения мышей, облученных в дозах 10 и 20 сГр, отмечен достоверно более высокий уровень апоптоза, обнаруженный на клеточном (рис. 3) и молекулярном уровнях (увеличение клеток с высоко фрагментированной ДНК, табл. 1). C одной стороны, у первого пост-облученного поколения наблюдается повышенный уровень повреждений ядерного материала, определенный на цитогенетическом (МЯ) и молекулярном (ДР ДНК) уровнях, а с другой стороны – усиление защиты генома путем активации процесссов репарации ДНК (замедление пролиферации) и повышение апоптоза (элиминации клеток с нере-парируемыми повреждениями ДНК) [15]. Но их активация недостаточна для поддержания спонтанного уровня повреждений у первого поколения облученных животных. На основе данных литературы и полученных нами результатов можно предположить, что постоянное формирование МЯ и двунитевых разрывов ДНК является следствием состояния повышенного уровня нестабильности генома соматических клеток потомков первого поколения облученных родителей [7, 13, 27]. Предполагают, что повышенный уровень нестабильности генома в соматических клетках потомства является следствием нерепарированных или ошибочно репарированных повреждений генома половых клеток родителей в некий тип изменений, стимулирующих повышенную вариабельность в целом [7, 27].

Оценка нестабильности генома у отдаленных потомков была проведена у второго-пятого поколения (F 2 -F 5 ) мышей, родители которых были облучены в дозе 30 сГр. Обращает на себя внимание то, что выявленный у F 1 достоверно более высокий уровень аберрантных клеток с МЯ и ДР ДНК (рис. 3), в последующих поколениях становится ниже контрольного уровня (табл. 2). У потомков F 2 – F 4 обнаружено достоверное понижение частоты двунитевых разрывов ДНК (%TDNA, табл. 2).

Таблица 2. Цитогенетические и молекулярно-клеточные эффекты в клетках костного мозга потомков (F 2 -F 5 ) мышей линии Af, облученных в дозе 30 сГр

Поколения		N	МЯ, ‰	Апоптоз, ‰	МИ, ‰	%ТDNA
F 2	контроль	9	33,7±2,2	8,3±1,1	2,6±0,6	14,3±1,1
	опыт	10	20,1±1,4*	3,8±0,6*	1,3±0,4*	10,9±0,9*
F 3	контроль	13	40,3±2,5	7,2±0,11	2,3±0,6	16,3±1,3
	опыт	12	34,8±2,9*	4,8±0,12*	0,1±0,1*	12,6±0,9*
F 4	контроль	10	53,9±2,3	12,7±1,1	6±0,77	20,1±1,2
	опыт	10	51,8±2,26	11±1,0	8,5±0,91*	16,4±1,2*
F 5	контроль	5	16,6±1,8	1,4±0,53	3,2±0,8	14,9±1,4
	опыт	6	15,3±1,6	1,3±0,46	3,3±0,74	14,2±1,4

Примечание: * - достоверность различий от контроля при p<0,05.

Снижение средних значений, характеризующих величину двунитевых разрывов ДНК, обусловлено достоверным повышением количества клеток с малоповрежденной ДНК, у которых в хвосте кометы фрагментов ДНК меньше 10% (рис. 4). При цитогенетическом исследовании клеток костного мозга F 2 –F 3 выявлено снижение количества клеток с микроядрами и митотического индекса, что может быть обусловлено усиленной репарацией ДНК на фоне снижения пролиферации [3, 6, 9]. По принципу обратной связи снижение повреждений ДНК (ДР ДНК и МЯ в F 2 –F 3 ) приводит к понижению количества клеток, подверженных элиминации (апоптозу) (табл. 2). У пятого поколения мы не обнаружили различий ни на клеточном, ни на молекулярном уровнях исследований.

Рис. 4. Гистограмма распределения ДНК в хвосте «кометы» (%ТDNA) клеток костного мозга мышей линии Af после хронического γ-облучения в дозе 30 сГр и их необлученных потомков (F 1 -F 5 )

Выводы: можно сделать заключение об эффективности хронического воздействия ИИ в малых дозах. Наблюдаемые в области низких доз генетические эффекты обусловлены не столько повреждающим действием ионизирующего излучения, сколько особенностями реализации ответной реакции клетки на слабые внешние воздействия [8]. В условиях хронического низкодозового воздействия ионизирующего излучения наблюдается немонотонные изменения количества повреждений ДНК в виде двунитевых разрывов ДНК и клеток с микроядрами, а также непостоянство пролиферативной активности (митотический индекс). Это свидетельствует об отсутствии линейной зависимости между дозой хронического низкодозового излучения и его эффектом в клетках костного мозга. Обнаруженные эффекты свидетельствуют об изменении чувствии-тельности животных к ИИ в процессе облучения, которая меняется от гиперчувствительности до радиорезистентности. Изменение знака эффекта малых доз ИИ может быть связано с изменением в системе защиты генома - повышение эффективности системы детоксикации свободных радикалов, активации процессов репарации ДНК, апоптоза клеток [3, 6, 9]. У потомков F1 облученных родителей выявлено наследование нестабильности генома, о чем свидетельствует увеличение числа клеток с МЯ и ДР ДНК. Зависимость эффектов радиационно-индуцированной нестабильности генома (РИНГ) от дозы облучения на клеточном и молекулярном уровнях имеют нелинейный вид - большую эффективность в первом поколении проявили более низкие дозы (10 и 20 сГр по сравнению с 30 сГр). Полагают, что феномен РИНГ является следствием неточной репарации повреждений структуры генома [7, 27]. Особенностью этого эффекта являя-ется эпигенетический характер их наследования, то есть наследование измененного состояния генной экспрессии [9, 21]. Изменение таких показателей клеточного гомеостаза как митотический индекс и апоптоз направлены на поддержание целостности генома. В отличие от первого поколения, у отдаленных потомков облученных мышей отмечено снижение частоты ДР ДНК (F2-F4) и клеток с микроядрами (F2-F3) ниже спонтанного уровня. У этих животных понижены также показатели, свидетельствующие об изменении пролиферативной активности и элиминации клеток, что может свидетельствовать о перестройке работы системы защиты клеток, которая к тому же передается последующим поколениям. Вероятно, переданная по наследству нестабильность генома потомкам облученных животных, выражается в активации механизмов защиты генома – процессов репарации и апоптоза.

Работа выполнена при поддержке проекта Президиума УрО РАН (№ 15-4-4-20).