Наследование общего содержания токоферолов в семенах подсолнечника в F1 и F2

Научная статья УДК 633.854.78

Введение. Токоферолы представляют собой группу жирорастворимых антиоксидантов, влияющих на пищевые и технологические свойства подсолнечного масла [1]. Токоферолы синтезируются только организмами, осуществляющими фотосинтез: высшими растениями, водорослями и циано-бактериями [2]. Их основная структура включает полярное хроманоль-ное кольцо и гидрофобную полипрениль-ную боковую цепь [3].

Четыре природные формы токоферолов (α, β, γ и δ) различаются числом и положением метильных заместителей аромати- ческого кольца, а также по своей витаминной активности in vivo и антиоксидантным свойствам in vitro [4–6]. Активность витамина E включает удаление пероксильных радикалов и гашение активных форм кислорода [3; 7]. Антиоксидантные свойства токоферолов способствуют долговечности семян за счет уменьшения накопления продуктов окисления липидов во время хранения [8].

Для человека и животных в большей степени полезен α-токоферол, так как он легче всего усваивается организмом [9] и предотвращает ряд заболеваний, связанных с дефицитом витамина Е [10; 11].

В зеленых частях растений – листьях и стеблях – находится α-токоферол, а в семенах преимущественно другие формы токоферола. Подсолнечник является исключением, и в его семенах α-токоферол занимает более 95 % от всех форм [12].

Фенотипическая изменчивость токоферолов в семенах подсолнечника, по разным данным, составляет от 119 до 667 мг/кг [13; 14], где более 95 % от всей фракции приходится на α-форму.

Изучая наследование токоферолов в семенах рапса, сои и подсолнечника, ученые пришли к выводу, что этот признак генетически контролируемый [15]. Условия среды могут иметь существенное влияние на изменчивость токоферолов в семенах, но основным фактором, обуславливающим количество токоферолов в семенах масличных культур, является генотип. Высокая температура в период налива семян ведет к повышению общего уровня токоферолов в семенах масличных культур [15–23].

При проведении скрининга на общее содержание токоферолов в семенах линий подсолнечника Del Moral с соавторами обнаружили, что генотипы с повышенным ОСТ имеют такой же уровень токоферолов и в пыльце, но не в листьях и корнях. В образцах с пониженным ОСТ был такой же показатель в пыльце и корнях, но не в листьях [24].

Довольно хорошо выяснен механизм биосинтеза токоферолов, который включает соединение фитилдифосфата с гомогенти-зиновой кислотой, с последующими реакциями циклизации и метилирования. Биосинтез токоферолов начинается в цитоплазме растения, а дальнейшие этапы, включая все промежуточные продукты и большинство ферментов, проходят на внутренней мембране оболочки хлоропласта [25].

Определены также многие функции токоферолов на уровне всего растения, начиная от прорастания и до старения [25]. Антиоксидантная активность токоферолов в разных тканях растений имеет воздействие на продолжительность жизни семян, покой и прорастание, старение листьев, а также развитие цветков и плодов. Токоферолы обнаружены в клетках мезофилла, где устраняют накопление активных форм кислорода и перекисное окисление липидов. При переработке семян подсолнечника токоферолы экстрагируются в масло и, частично, остаются в шроте, повышая их питательную ценность.

В исследованиях Del Moral с соавторами утверждается, что в семенах подсолнечника F 1 содержание токоферолов было такое же, как и у материнской родительской линии, то есть наблюдался материнский эффект, тогда как в семенах F 2 такого эффекта не отмечено [27]. Сообщается также, что в расщепляющейся популяции F 2 у подсолнечника обнаруживается трансгрессия, из которой в дальнейшем возможно отобрать линии с повышенным содержанием токоферолов, что соответствует аддитивному характеру наследования генов [26; 27].

Однако недостаточно информации о влиянии генотипической среды при гибридизации на содержание токоферолов в ядрах подсолнечника.

Целью работы было изучить наследование общего содержания токоферолов в семенах подсолнечника в поколениях F 1 и F 2 .

Материалы и методы. Исследования проводили на полях первого отделения центральной экспериментальной базы ВНИИМК, г. Краснодар, в 2016–2017 гг. В испытании участвовали семь самоопы-ленных линий селекции ВНИИМК: ВК653, ВК639, СЛ07383, ВК591, Л690, СЛ081858, СЛ132232. Полевые опыты выполняли согласно общепринятой методики в течение двух лет. Делянки родительских линий и гибридных растений на поле были однорядными с расстановкой растений 35 × 70 см.

Для получения семян родительских линий в 2016 г. перед цветением изолировали не менее пяти растений подсолнечника, затем проводили самоопыление. Дополнительно перед цветением изолировали по две корзинки каждой родительской линии для проведения реципрокных скрещиваний, которые осуществлялись с помощью ручной кастрации в 2016 г. Уборку производили индивидуально, семена от каждой корзинки высыпали в отдельный бумажный пакет.

В 2017 г. были посеяны семь родительских линий на однорядных делянках, на каждой из которых изолировали перед цветением по пять корзинок для самоопыления и получения семян. Из семян F 1 в полевых условиях 2017 г. получили гибридные растения, посеянные на однорядных делянках. По пять растений на каждой делянке перед цветением изолировали, затем проводили принудительное самоопыление для получения семян F 2 .

Годы проведения опытов различались по метеорологическим условиям, но в целом были благоприятными для получения достоверных данных. Средняя температура воздуха за летние месяцы в 2016 г. была 25,5 °С, в 2017 г. поднималась до 24,4 °С. Количество выпавших осадков за летние месяцы в 2016 г. составило 310 мм, в 2017 г. – 277 мм, при климатической норме за этот период 232 мм.

Общее содержание токоферолов (ОСТ) в семенах определяли согласно модификации разработанного во ВНИИМК метода Эммери-Энгеля [28]. Для проведения анализа на содержание токоферолов использовали по три корзинки каждой из семи са-моопыленных линий в 2016 и 2017 гг. Также изучали по две корзинки от каждого скрещивания семян F 1 в 2016 г.

Далее на делянках с гибридными растениями в 2017 г. выбирали по три самоопы-ленных корзинки с семенами F 2 .

Из средней пробы семян каждой из выбранных корзинок отбирали пробу 2 г. Отобранные семена лузжили, ядра тонко измельчали на лабораторной мельнице, из измельченных ядер отбирали три навески по 200 мг. В мерную пробирку (10 см3 с притёртой пробкой) с навеской добавляли 5 мл гексана, настаивали не менее 8 часов при периодическом помешивании. Через сутки из пробирки отбирали 1 мл гексанового слоя, последовательно добавляли 3 мл этилового спирта, 0,5 мл 0,25 % раствора α-дипиридила в абсолютном спирте и 0,5 мл 0,1 % хлорного железа (FeCl3) в абсолютном спирте. После выдерживания в темноте в течение 20 минут измеряли оптическую плотность окрашенного раствора на спектрофотометре ПЭ-5400ВИ. Параллельно определяли величину оптической плотности раствора в пустом опыте. Расчет общего содержания токоферолов производили по формуле, учитывая, что продукт реакции 1 г α-токоферола в 1 л спирта в вышеуказанных условиях имеет оптическую плотность 39,7 при толщине слоя 1 см. В этом случае содержание токоферолов в навеске из размолотых ядер семян (Х) в мг/кг рассчитывали по формуле:

Х = Д × V / 0,397 × H × 5, где Д – концентрация α-токоферола в анализируемом растворе;

• V – объём раствора, мл;

Н – масса навески, мг.

Полученные результаты обрабатывали с использованием компьютерной программы Excel. Показатель степени доминирования признака рассчитывали по формуле, предложенной К. Мазером и Дж. Джинксом [15].

Результаты и обсуждение. Диапазон изменчивости изучаемого признака в семенах семи родительских линий подсолнечника за два года исследования условно разделили на низкое, среднее и повышенное. В первую группу вошли три линии: СЛ 07 383 (273–289 мг/кг), ВК653 (338–357 мг/кг)

и ВК639 (244–322 мг/кг). В составе второй группы были две линии: СЛ132232 (475–498 мг/кг) и Л690 (436–494 мг/кг). В категорию с повышенным ОСТ включены две линии: ВК591 (528–605 мг/кг) и СЛ081858 (495–628 мг/кг) (табл. 1).

Таблица 1

Общее содержание токоферолов (мг/кг) в семенах родительских линий подсолнечника

ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК, г. Краснодар, 2016 г.

Table 1

Total tocopherol content (mg/kg) in the seeds of sunflower parental lines

V.S. Pustovoit All-Russian Research Institute of Oil Crops, Krasnodar, 2016

Категория	Генотип	2016 г.			2017 г.
		min–max	среднее	CV, %	min–max	среднее	CV, %
Min	СЛ 07 383	240–365	289	20	207–318	273	11
	ВК653	282–367	338	10	333–372	357	6
	ВК639	269–391	322	17	154–334	244	28
Mid	СЛ 13 2232	407–512	475	8	442–550	498	10
	Л690	423–552	494	9	398–501	436	8
Max	ВК591	504–709	605	10	473–612	528	7
	СЛ 08 1858	524–721	628	10	426–581	495	12

Содержание токоферолов в семенах линий в 2016 г. составило от 289 мг/кг у СЛ 07 383 до 628 мг/кг у СЛ 08 1858, в 2017 г. – от 244 у ВК639 до 528 мг/кг у ВК591. При этом ОСТ в 2017 г. в пяти линиях снизилось, тем не менее они остались в тех же группах (min, mid, max). Варьирование по растениям внутри линий в 2016 г. было от 8 % у СЛ 13 2232 до 20 % у СЛ 07 383, в 2017 г. – от 6 % у ВК653 до 28 % у ВК639.

Доля наследуемости в ряду родитель-потомок для самоопыленных линий, измеренная коэффициентом корреляции, равна

0,91 с коэффициентом детерминации 0,83 (табл. 4), что существенно на 5%-ном уровне значимости.

В 2016 г. были произведены 10 реципрокных скрещиваний между семью линиями.

Наименьшие значения в F 1 (338 и 379 мг/кг) получены при скрещивании линий с пониженным ОСТ – СЛ 07 383 и ВК653, где между реципрокными комбинациями нет достоверных различий (в среднем 41 мг/кг) и результаты незначительно отличаются от родителей (табл. 2).

Таблица 2

Общее содержание токоферолов (мг/кг) в семенах родительских линий подсолнечника и реципрокных F 1

ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК, г. Краснодар, 2016 г.

Table 2

Total tocopherol content (mg/kg) in the seeds of sunflower parental lines and reciprocal F 1 hybrids

V.S. Pustovoit All-Russian Research Institute of Oil Crops, Krasnodar, 2016

Категория	Генотип	♀	♂	F 1		НСР 05 *	h/d
				Среднее	min–max
Min × min	СЛ 07 383 × ВК653	289	338	379	326–410	55	2,6
	ВК653 × СЛ 07 383	338	289	338	319–365		1,0
Min × mid	СЛ 07 383 × Л690	289	494	465	428–512	52	0,7
	Л690 × СЛ 07 383	494	289	390	389–391		0,0
Min × max	ВК653 × СЛ 08 1858	338	628	474	440–496	108	-0,1
	СЛ 08 1858 × ВК653	628	338	604	571–667		0,8
	ВК639 × ВК591	322	605	396	379–412	60	-0,5
	ВК591 × ВК639	605	322	460	428–483		0,0
Mid × max	СЛ 13 2232 × ВК591	475	605	415	411–420	85	-1,9
	ВК591 × СЛ 13 2232	605	475	468	440–496		-1,1
Среднее		450	–	439	–	–	–
НСР 05		52	–	46	–	–	–

* – между реципрокными

В парах реципрокных скрещиваний из категорий min × mid и min × max родительские формы существенно различались между собой по ОСТ в 2016 г.: у пары СЛ 07 383 и Л690 различие составило 205 мг/кг, у линий ВК653 и СЛ 08 1858 – 289 мг/кг, а у ВК639 и ВК591 – 282 мг/кг.

В скрещивании линий СЛ 07 383 и Л690 разность между реципрокными F 1 (390 и 465 мг/кг) оказалась значительна и составила 75 мг/кг; показатель степени доминирования h/d – от промежуточного 0,0 до неполного доминирования 0,7 с отклонением к отцовской Л690.

При гибридизации линий ВК653 и СЛ₀₈1858 в F 1 получены значения 474 и 604 мг/кг, которые существенно различаются – на 130 мг/кг. Степень доминирования составила от промежуточного -0,1 до неполного доминирования 0,8 с отклонением к материнской родительской линии.

При скрещивании контрастных генотипов ВК639 и ВК591 реципрокные F 1 (396 и 460 мг/кг) различаются на 64 мг/кг с отклонением к материнской линии ВК639. Характер наследования промежуточный, значения h/d равны от -0,5 до 0,0.

В результате скрещивания линий со средним (СЛ 13 2232) и повышенным (ВК591) ОСТ между реципрокными F 1 (415 и 468 мг/кг) различие незначительно – на 53 мг/кг, при этом оба значения близки к генотипу СЛ 13 2232 (табл. 2).

Наблюдается тенденция, что с увеличением ОСТ в материнской родительской линии повышается значение и в F 1 , что отражает корреляция r, равная 0,57 (табл. 4).

В 2017 г. существенные различия сохраняются между теми же генотипами с контрастным значением ОСТ. В категории min × mid это 163 мг/кг между родительскими линиями СЛ 07 383 и Л690, в группе min × max – 138 мг/кг между ВК653 и СЛ 08 1858 и 284 мг/кг между ВК639 и ВК591.

Содержание токоферолов в средних пробах семян F 2 оказалось минимальным (285 и 305 мг/кг) в группе min × min в гибридах от скрещивания линий СЛ 07 383 и ВК653. При этом значения ОСТ реципрокных F 2 были близки как между собой, так и с родительскими линиями (табл. 3).

В F 2 при гибридизации линий СЛ 07 383 и Л690 из категории min × mid различий между реципрокными скрещиваниями нет (374 и 387 мг/кг), разность составила 13 мг/кг, наследование признака характеризуется как промежуточное (h/d = 0,2 и 0,4).

При скрещивании линий ВК653 и СЛ 08 1858 из категории min × max между реципрокными F 2 (378 и 502 мг/кг) есть значительное различие (123 мг/кг) с отклонением к отцовской форме. Показатель h/d, соответственно, отражает доминирование (1,1) и неполное отрицательное доминирование (-0,7) отцовского родителя.

В комбинациях с линиями ВК639 и ВК591 из той же группы реципрокные F 2 (407 и 529 мг/кг) существенно различаются – на 122 мг/кг. Доминирование в одном из скрещиваний направлено к материнской линии с оценкой h/d, равной 1,0, в другом – промежуточный тип наследования (h/d = 0,1).

Скрещивая две линии со средним (СЛ 13 2232) и повышенным (ВК591) ОСТ, в результате получили реципрокные F 2 (452 и 515 мг/кг), сходные как с родительскими формами, так и между собой, с незначительным различием (63 мг/кг) (табл. 3).

Для потомства F 2 сохраняется закономерность, что с увеличением ОСТ в материнской линии соответственно повышается величина признака и в семенах F 2 (r = 0,55) (табл. 4). Более же достоверная сопряженная изменчивость наблюдается между среднеродительским в 2017 г. и F 2 с r = 0,71.

Таблица 4

Коэффициенты корреляции между показателями ОСТ в семенах подсолнечника родительских линий, F 1 и F 2

ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК, г. Краснодар, 2016–2017 гг.

Table 4

Correlation coefficients between TTC values in sunflower seeds from parental lines, F 1 and F 2

V.S. Pustovoit All-Russian Research Institute of Oil Crops, Krasnodar, 2016–2017
	♀ 2017	♂ 2017	F 1
♀ 2016	0,91*	–	0,57
♂ 2016	–	0,91*	0,08
F 2	0,55	0,36	0,40

* – существенно на 5%-ном уровне значимости

Таблица 3

Общее содержание токоферолов (мг/кг) в семенах родительских линий подсолнечника и реципрокных F 2

ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК, г. Краснодар, 2017 г.

Table 3

Total tocopherol content (mg/kg) in the seeds of sunflower parental lines and reciprocal F 2 hybrids

V.S. Pustovoit All-Russian Research Institute of Oil Crops, Krasnodar, 2017

Категория	Генотип	♀	♂	F 2		НСР 05 *	h/d
				среднее	min–max
Min × min	СЛ 07 383 × ВК653	273	357	305	287–329	103	-0,2
	ВК653 × СЛ 07 383	357	273	285	222–326		-0,7
Min × mid	СЛ 07 383 × Л690	273	436	387	369–397	90	0,4
	Л690 × СЛ 07 383	436	273	374	345–431		0,2
Min × max	ВК653В × СЛ 08 1858	357	495	502	471–552	79	1,1
	СЛ 08 1858 × ВК653	495	357	378	363–388		-0,7
	ВК639 × ВК591	244	528	407	374–425	61	0,1
	ВК591 × ВК639	528	244	529	510–551		1,0
Mid × max	СЛ 13 2232 × ВК591	498	528	452	436–465	40	-4,0
	ВК591 × СЛ 13 2232	528	498	515	496–532		0,1
Среднее		403	–	414	–	–	–
НСР 05		51	–	49	–	–	–
CV, %		28	–	20	–	–	–

— между реципрокными

Заключение. Выявлена высокая наследуемость общего содержания токоферолов в семенах самоопыленных линий подсолнечника в ряду родитель-потомок, оцененная коэффициентом корреляции, r = 0,91, то есть 82 % общей изменчивости изучаемого признака в линиях объясняется генотипом, что согласуется с полученными ранее результатами о высокой наследуемости ОСТ в ряду родитель-потомок для константных генотипов [28].

При гибридизации линий с низким ОСТ в семенах уровень его в F 1 и F 2 остается таким же, как и у родительских форм. При скрещивании двух контрастно различающихся по изучаемому признаку линий ОСТ наследуется, в основном, по промежуточному типу, что соответствует аддитивному действию генов. В результате скрещивания двух линий с повышенным уровнем ОСТ значения в F 1 ближе к родителю с низким значением, тогда как в семенах F 2 величины ОСТ незначительно различаются как с родительскими, так и между собой.

Несмотря на то, что материнский эффект в F1 наблюдается только в трех комбинациях – СЛ081858 × ВК653 (h/d = 0,8), ВК639 × ВК591 (h/d = -0,5) и СЛ132232 × ВК591 (h/d = -1,9), прослеживается тенденция, что с увеличением ОСТ в материнской форме повышается его уровень и в гибридных семенах F1 (r = 0,55), а также семенах F2 (r = 0,57).

Вместе с тем взаимосвязь средних родительских показателей ОСТ с F 1 оказалась такой же, как с материнской линией (r = 0,55), а с F 2 – еще ближе – r = 0,71. Очевидно, что для того, чтобы получить генотипы с повышенным общим содержанием токоферолов в семенах F 2 , необходимо, чтобы таковым был хотя бы один из родительской пары, так как при гибридизации двух линий с пониженным содержанием токоферолов уровень ОСТ в гибриде не увеличивается.