Научно-методологический подход к утилизации фармацевтических отходов на основе биотехнологий и математического моделирования

Актуальной проблемой, возникающей при уничтожении отходов, является обеспечение экологической безопасности используемых технологий. При выборе наиболее эффективных способов обезвреживания определенных категорий опасных отходов предпочтение отдается биотехнологическим способам. В настоящее время в России и за рубежом отсутствуют биотехнологические способы утилизации опасных фармацевтических отходов, в том числе непригодных к медицинскому использованию лекарственных средств – фальсифицированных, забракованных, с истекшим сроком годности и пр. Данные лекарственные средства относятся в основном к первому или второму классам опасности и подлежат обязательному уничтожению. Однако рекомендуемые методы их утилизации (слив в канализацию, сжигание и захоронение на санитарных полигонах) не являются экологически безопасными.

Как показано нами ранее [5, 6], технологически перспективными для осуществления направленных биотрансформаций лекарственных веществ, содержащих в своей структуре фенольную гидроксильную группу (в частности, парацетамола, ацетилсалициловой кислоты, салициловой кислоты и др.), являются актинобактерии рода Rhodococcus [7]. Для расширения объектов биодеструкции среди лекарственных средств необходим единый методологический подход к утилизации фармацевтических отходов, обеспечивающий возможность превращения их в безопасные для окружающей природной среды соединения.

В связи с этим цель настоящих исследований – разработка научнометодологического подхода к утилизации некачественных лекарственных средств, производных фенола, на основе использования микроорганизмов и математического моделирования.

Материалы и методы

В работе применяли традиционные методы бактериологии, в том числе метод кометаболизма, метод биотрансформации веществ с использованием покоящихся и иммобилизованных бактериальных клеток. Для закрепления клеток использовали способ включения их в криогель поливинилового спирта [10] и сорбционный метод иммобилизации родококков на твердых носителях. С целью повышения сродства поверхности адсорбентов к бактериальным клеткам использовали прием гидрофобизации поверхности носителя с помощью Rhodococcus -биосурфактантов. Оценку интенсивности адгезии бактериальных клеток на модифицированной поверхности твердых носителей проводили методами инфракрасного сканирования и профилометрии высокого разрешения с использованием инфракрасной камеры CEDIP Silver 450 M ( CEDIP Infrared Systems , Франция) и интерференционного микроскопа NewView 5000 ( Zygo Corporation , США) соответственно. Оптимизацию процесса биодеструкции парацетамола с использованием иммобилизованного биокатализатора проводили в условиях лабораторного биореактора. О скорости процесса биодеградации лекарственных веществ судили по степени их убыли из среды культивирования родококков, регистрируемой методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием хроматографа модели HP -1090 ( Hewlett Packard , США) и колонки ZORBAX SB–C 18 (4,6×250 мм, 5 µм), заполненной октадецильной привитой фазой [6]. Количественное содержание первичного метаболита p -аминофенола в культуральных жидкостях определяли фотометрическим методом с помощью спектрофотометра типа Lambda EZ 201 ( Perkin-Elmer , США) при λ = 450 нм на основе цветной реакции конденсации p -аминофенола с п -диметиламинобензальдегидом [6]. Класс опасности культуральной жидкости и шлама после биодеструкции парацетамола определяли расчетным методом в соответствии с [11] на основании известных токсикологических [9] и эколого-гигиенических [8] показателей p -аминофенола и значения LD 50 осадка (шлама), определенного по методу В.В. Прозоровского [12].

Результаты и их обсуждение

В результате направленной биодеградации некачественных лекарственных средств, производных хинолина, изохинолина, фенотиазина, пиразола, имидазола, бензимидазола, ацетанилида, фурана, бензгидрола, бензойной, пара-аминобензойной, дифенилуксусной и диэтиламинопропановой кислот нами установлено, что родококки характеризуются наиболее выраженной деструктивной активностью в отношении дротаверина (но-шпы), бензоата натрия и тримекаина. Выявлены основные стадии и отдельные продукты биодеградации исследуемых соединений; определены кинетические и термодинамические параметры; подобраны оптимальные условия биоконверсии лекарственных средств в виде фармацевтических субстанций и лекарственных форм. Разработаны технологические схемы процесса утилизации фармацевтических отходов с использованием коллекционных штаммов R. erythropolis

ИЭГМ 767, R. rodochrous ИЭГМ 647, R. ruber ИЭГМ 77, ИЭГМ 228, ИЭГМ 235 [7] – активных катализаторов процесса биодеградации исследуемых соединений.

Для достижения наибольшей степени эффективности и операционной стабильности данных биокатализаторов использован сорбционный метод иммобилизации целых клеток родококков на модифицированных поверхностях твердых носителей. Экспериментально обоснована возможность оптимизации процесса иммобилизации с использованием Rhodococcus -биосурфактантов. Полученные с помощью интерференционного микроскопа изображения свидетельствуют о том, что иммобилизация родококков имеет монослойный характер, клетки располагаются по всей поверхности носителя. При этом существует предел насыщения носителя бактериальными клетками, после чего резко снижается скорость адсорбции, и клетки практически не оседают на его поверхности. На основании полученных данных определена оптимальная (10⁷ клеток/мл) концентрация клеток родококков в суспензии при проведении процедуры иммобилизации.

Разработанный биокатализатор характеризуется высокой каталитической активностью закрепленных клеток: скорость разложения парацетамола составляет 116 мг/(л∙ч). Использование иммобилизованных на модифицированном древесном опиле клеток родококков, предварительно адаптированных к фенолу, позволяет существенно сократить продолжительность процесса биодеструкции парацетамола – с 4 суток до 20 часов.

Оптимизация процесса биодеструкции парацетамола с использованием разработанного биокатализатора проведена в условиях лабораторного биореактора. Предварительно с помощью математического моделирования определены оптимальные значения температуры в интервале от 28 до 35 °С и скорости перемешивания среды от 160 до 200 об/мин, обеспечивающие максимальную величину константы скорости реакции разложения парацетамола (рис. 1) Штриховыми линиями на горизонтальной плоскости на рис. 1 показаны технологические ограничения на орбитальную скорость и температуру среды инкубации родококков. Коэффициент k 1 имеет явную тенденцию к увеличению с повышением температуры и скорости перемешивания. Максимальное значение k 1 находится на границе допустимой области по температуре и имеет тенденцию роста при этой температуре в сторону увеличения скорости перемешивания. В условиях эксперимента для орбитального шейкера k 1 max = 1,233 сут^-1 при Т = 35 °С и n = 200 об/мин.

Полученное решение задачи оптимизации процесса биодеструкции парацетамола использовано для перехода к универсальным характеристикам параметров процесса: температуре и скорости перемешивания культуральной жидкости. После определения этих характеристик возможен переход к реальным управляющим технологическим параметрам для проведения процесса в полупромышленных и промышленных условиях. Это обусловлено тем, что температуру в полупромышленной установке (ферментере) можно привести в соответствие с температурой в лабораторной установке – шейкере, а переход от орбитальной скорости в шейкере к эквивалентной угловой скорости вращения мешалки в ферментере представляется возможным через интенсивность перемешивания культуральной жидкости [2].

По нашим данным, для реализации оптимального значения k 1 max = 1,233 сут^-1 при Т = 35 °С и n = 200 об/мин в лабораторных условиях необходима интенсивность перемешивания I пер = 0,5 с^-1. Аппроксимируя точки прямой 2 (рис. 2) в силу

Рис. 1. Зависимость константы скорости реакции k1 биокаталитического окисления парацетамола клетками R. ruber ИЭГМ 77 от орбитальной скорости вращения шейкера и температуры среды инкубации родококков линейности до оптимальной интенсивности перемешивания в колбе (шейкере), находим значение n = 200 об/мин. Это значение можно считать начальной точкой угловой скорости вращения мешалки в ферментере при проведении процесса в полупромышленных условиях. Начальная точка температуры при этом составляет Т = 28 °С. Найденные технологические параметры являются начальным приближением при разработке технологии процесса биодеструкции парацетамола в полупромышленных условиях.

Как показано нами ранее [3], возможность прогнозирования содержания продуктов реакции во времени обеспечивает математическая модель, построенная на основании схемы биодеструкции (рис. 3) и представляющая собой систему дифференциальных уравнений первого порядка, которая имеет вид

—¹ = - ( b + k • t ) • X ], dt

d ( x ₂ + x, )

----²----— = K • ( b + k • t ) • X - ( c + d • t ) • x ₂,

H2O                 1                   2

d^ = K dt     CH3COOH

• K H₂O • ( b + k • t) • X 1 ,

—4 = K_o • ( c + d • t) • x₇, I dt      O²

с начальными условиями

^X 1 ^ = o ^X 1 , ^x 2 I t = 0 ^x 3 I t = 0 ^X 4 I t = 0 0,                             ⁽²⁾

где х 1 , х 2 , х 3 , х 4 – концентрации парацетамола, p -аминофенола, уксусной кислоты и остальных продуктов разложения парацетамола соответственно.

n. об/мин

Рис. 2. Зависимость интенсивности перемешивания жидкости в колбе ( 1 ) и ферментере ( 2 ) от скорости вращения шейкера и мешалки ферментера

NHCOCH3         NH2

и-аминофенол пирокатехин цис, цис-муконовая кислота

парацетамол

NH3|

гидрохинон

^*1ТГ-1ЛХУТПТГХП иснзохинин

Рис. 3. Схема биодеструкции парацетамола с использованием клеток R. ruber ИЭГМ 77

Присутствующие в кинетических уравнениях коэффициенты K _H2O , K _CH3COOH , K _O2 для открытой системы рассчитаны на основании закона сохранения молекулярных масс участвующих в реакциях соединений (см. рис. 3). Параметры «констант» скорости реакций b , k и c , d для парацетамола и p -аминофенола соответственно получены на основе экспериментальных данных [3].

Разработанная модель адекватно описывает процесс биодеструкции парацетамола как открытой системы [4] свободными и иммобилизованными клетками родококков и дает возможность прогнозировать его окончание по убыли токсичного метаболита – p- аминофенола (рис. 4, 5). Пунктирными линиями на рис. 4, 5 обозначены содержание p- аминофенола и время окончания процесса.

В процессе биодеструкции парацетамола происходит снижение класса опасности отхода с I до IV и V. Так, по нашим данным, парацетамол и p- аминофенол относятся к I классу опасности для окружающей природной среды [1], то есть являются чрезвычайно опасными отходами. Культуральная жидкость по достижении в ней концентрации p- аминофенола, равной 0,0005 г/мл, становится малоопасным отходом (IV класс опасности для окружающей природной среды) и может быть размещена на санитарном полигоне через 6 суток при использовании свободных клеток родококков (см. рис. 4) или через 19 часов при использовании иммобилизованных клеток (см. рис. 5). При этом после завершения процесса содержание парацетамола в среде становится равным нулю. Образующийся в процессе биодеструкции осадок (шлам) малотоксичен ( LD 50 > 4000 мг/кг), относится к V классу опасности (практически не опасен) для окружающей природной среды и наряду с культуральной жидкостью может быть размещен на санитарном полигоне твердых бытовых отходов.

Таким образом, на примере парацетамола разработан методологический подход к исследованию процесса биодеструкции непригодных к медицинскому использованию лекарственных средств, который включает в себя следующий алгоритм: 1) в результате изучения механизма сложного химического процесса, происходящего при биодеструкции лекарственного вещества, устанавливается схема данного процесса; 2) на основании скрининга производится отбор наиболее активных штаммов-биодеструкторов используемого соединения;   3) экспериментальным путем подбираются рациональные условия проведения процесса биодеструкции (состав среды, концентрация исходного субстрата, температура инкубации, интенсивность перемешивания, добавка косубстрата и др.); 4) проводится ограниченный ряд экспериментов для определения константы скорости реакции биокаталитического окисления исследуемого вещества, а также основных продуктов его разложения как исходных субстратов; 5) по схеме процесса биодеструкции строится математическая модель (система кинетических уравнений) для исходного субстрата и продуктов его разложения с учетом особенностей открытой системы и параллельной (одновременной) биодеградации исследуемого вещества и продуктов его разложения в реальном процессе; 6) в условиях эксперимента проверяется адекватность предложенной модели; 7) определяются начальные значения технологических параметров (температуры, скорости вращения мешалки и др.) для проведения процесса биодеструкции лекарственного вещества в полупромышленных и промышленных условиях.

Заключение

• 1.    На примере парацетамола изучена кинетика процесса биодеструкции некачественных лекарственных средств, производных фенола. Установлена зависимость между скоростью процесса биодеструкции парацетамола и условиями

• 2.    Разработана математическая модель процесса биодеструкции парацетамола с учетом особенностей открытой системы, позволяющая прогнозировать поведение исходного субстрата и продуктов его разложения, а также окончание процесса биодеструкции парацетамола по убыли p -аминофенола.

• 3.    Показано, что в процессе биодеструкции парацетамола происходит снижение класса опасности отхода с I до IV и V, что позволяет размещать фармацевтические отходы на санитарном полигоне твердых бытовых отходов.

• 4.    С использованием методов математического моделирования на примере парацетамола разработан методологический подход к изучению процессов биодеструкции некачественных лекарственных средств, производных фенола.

Рис. 4. Экспериментальные (точки) и теоретические (линии) зависимости от времени концентрации парацетамола х 1 , p -аминофенола х 2 и остальных продуктов разложения х 4 в процессе биодеструкции парацетамола свободными клетками R. erythropolis ИЭГМ 767

Рис. 5. Экспериментальные (точки) и теоретические (линии) зависимости от времени концентрации парацетамола х 1 , p -аминофенола х 2 и остальных продуктов разложения х 4 в процессе биодеструкции парацетамола иммобилизованными клетками R. erythropolis ИЭГМ 767

его проведения (температурой, интенсивностью перемешивания культуральной жидкости).

Благодарности

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (гранты № 04–04–96057–р_Урал_а, № 07–04–96038–р_Урал_а).