Неинвазивные методы оценки стресс-индуцированных изменений гормонального и иммунного гомеостаза

Неинвазивные технологии исследования являются более предпочтительными для повседневного использования, чем инвазивные, при условии высокой чувствительности и специфичности применяемых методов. К такого рода методам относятся современные лабораторные иммунологические технологии исследования биологических жидкостей на содержание гормонов и регуляторных пептидов и для оценки состояния гуморальных систем, обеспечивающих противомикробную защиту организма. Между тем при оценке гормональной регуляции и состояния иммунитета, в том числе стресс-индуци-рованного характера, общепринято использование иммунологических методов с определением показателей в крови. Нами сделана попытка оценить возможность применения неинвазивных методов определения некоторых гормональных и иммунных показателей для выявления стресс-индуцированных нарушений гомеостаза путем изучения этих показателей в слюне.

Цель исследования: определение иммунных показателей слюны для верификации стресс-индуцированных изменений при воздействии на организм человека экстремального холодового, а также психо-эмоционального стресса.

Материалы и методы. В настоящее исследование было включено 63 человека: 23 мужчины в возрасте 25-35 лет и 40 студентов в возрасте 19-21 года. В качестве стрессовых нагрузок использовались модели общего охлаждения организма и психоэмоциональный стресс. Кратковременное экстремальное охлаждение поверхности тела (ниже уров ня шеи) проводилось однократно направленными потоками сухой воздушно-азотной смеси с температурой от -130 до -140 °C на установке КАЭКТ-01-«КРИОН». Длительность процедуры составляла 60 с. В качестве психо-эмоционального стресса использовали общепринятый в нейроиммунологии экзаменационный стресс [4], у студентов медицинской академии.

Для оценки развития стресс-индуцированных изменений организма с помощью неинвазивных технологий определяли уровень кортизола, общую активность системы комплемента и ее отдельных компонентов, характер изменения нитроксидерги-ческой регуляции на основе определения показателей слюны. Исследование проводилось до и сразу после стрессового воздействия.

Слюну забирали после осмотра стоматолога у лиц без признаков зубной и иной патологии в ротовой полости, натощак, в утренние часы после полоскания рта водой. Забор материала проводили через 10 мин без стимуляции слюноотделения.

В биологической жидкости определяли: активность комплемента по 50 % гемолизу (Резникова Л.С., 1967; Кэбот Е. и Мейер М., 1968); активность компонентов комплемента С1-С5 методом молекулярного титрования (Красильников А.П., 1984; Shinobu А., Tanaka S. et al., 1986) с учетом результатов реакции на планшетном фотометре «Multiscan plus». Уровни кортизола, sFas рецептора, IL-12 определяли с помощью иммуноферментного анализа. При измерении количества кортизола использовали тест-систему для определения гормона в слюне

CORTISOL ELISA Kit, 96 (ВВС); для измерения уровня растворимого Fas-рецептора в слюне применяли тест-систему sAPO -1/FAS, 96 (Bender Medsystems), а для определения IL-12 - тест-систему Interlukine-12 (р 40 + р 70), 96 (Bender Medsystems). Определение уровня оксида азота в слюне проводили модифицированным методом Griess (Коробейникова Э.Н., 2002).

Статистическая обработка проведена с применением программного комплекса Statistica for Windows версия 6.0 фирмы StatSoft Inc. (США). В таблицах представлены данные в виде универсальной средней - медианы (Me) и межквартильного интервала (Q25-Q75), достоверность различий до и после воздействия стрессовых факторов верифицирована непараметрическими методами по критерию Колмогорова - Смирнова. Минимальный уровень достоверности различий между группами р < 0,05 [2], при значениях р < 0,1 различия оценивались как статистически вероятные [3].

Результаты исследования и обсуждение

Группа лиц, которые подвергались воздействию охлаждающей воздушной смеси, составила 23 человека, средний возраст обследуемых 39,5 лет. Результаты определения показателей слюны с помощью иммунологических методов до и после воздействия охлаждения азот - воздушной смесью приведены в табл. 1.

Как видно из табл. 1, при кратковременном общем охлаждающем воздействии на организм азот-воздушной смеси в слюне происходит достоверное повышение уровня кортизола, рост количества которого в биологических жидкостях является характерным маркером изменений функции надпочечников стресс-индуцированного характера [1,5].

Из таблицы следует, что общая активность системы комплемента достоверно не меняется под влиянием экстремального холодового стресса в отличие от активности отдельных компонентов системы, которая существенно и с высокой степенью достоверности снижается после кратковременного воздействия стресса. После холодового воздействия у обследуемых лиц произошло снижение в слюне активности всех изучаемых компонентов классиче ского пути активации, функционирующих по принципу ограниченного протеолиза (Cl, С2, СЗ, С4, С5), что может быть связано с ферментативной деградацией отдельных белков и других химических соединений в результате формирования катаболического профиля обмена веществ, характерного для постстрессовых реакций организма.

Согласуется с этими данными также снижение на уровне статистически вероятной тенденции в слюне количества растворимого sFas рецептора, участвующего в регуляции процессов апоптоза клеток (р = 0,056). Падение уровня растворимого рецептора может быть связано с зависящим от действия низких температур уменьшения продукции мембранных и растворимых рецепторов клетками, либо с расщеплением растворимых белков, находящихся в сыворотке крови, в ходе усиления процессов протеолиза. Наибольший интерес представляет выявление на уровне статистически вероятной тенденции роста в слюне уровня IL-12, продуцентом которого являются антиген-представля-ющие клетки, что свидетельствует об усилении активности этих клеток при холодовом стрессе и что может иметь принципиальное значение для усиления клеточного иммунного ответа стресс-индуцированного характера.

Воздействие стресса на организм приводит к изменению уровня внутриклеточных мессенджеров, к которым относится NO. Оксид азота является газообразным продуктом и поэтому уровень его меняется не только внутри клеток-продуцентов, но в общем объеме биологических жидкостей, омывающих клетки. Основным продуцентом индуцибель-ного NO являются макрофаги [4, 5]. Для оценки уровня оксида азота до и после экстремального воздействия холода в слюне определяли терминальные стабильные метаболиты оксида азота: нитриты, нитраты и суммарные метаболиты. Результаты представлены в табл. 2.

Данные табл. 2 свидетельствуют о многократном повышении конечных стабильных метаболитов оксида азота в слюне при воздействии такого экстремального холодового фактора как действие охлаждающей азот-воздушной смеси, с которым че-

Таблица 1

Влияние общего холодового воздействия на показатели слюны

Показатель	До криосауны		После криосауны		Р
	Me	Q25-Q75	Me	Q25-Q75
Уровень кортизола, нг/мл	4,9	4-5,6	8	7-9	0,001
Общая активность комплемента (СП 50)	52,3	50-54,2	51,6	50,4-53,9	0,5
С1 х 108 эфф. мол/мл	0,237	0,216-0,261	0,089	0,087-0,098	0,001
С2 х 108 эфф. мол/мл	0,229	0,187-0,242	0,098	0,087-0,108	0,001
СЗ х 108 эфф. мол/мл	0,221	0,195-0,261	0,114	0,1-0,12	0,001
С4 х 108 эфф. мол/мл	0,261	0,214-0,281	0,128	0,116-0,137	0,001
С5 х 108 эфф. мол/мл	0,266	0,204-0,280	0,139	0,129-0,146	0,001
sFas	466,3	395,0-541,2	306,9	263,1-309,4	0,056
IL-12	5,47	4,15-5,99	7,10	6,76-7,75	0,057

Рахматулина Э.Х., Теплова С.Н., Альтман Д.А.

Неинвазивные методы оценки стресс-индуцированных изменений гормонального и иммунного гомеостаза ловек никогда ранее не встречался в ходе эволюции. Отмечен рост в слюне всех изучаемых метаболитов NO с высокой степенью достоверности, что позволяет утверждать увеличение продукции макрофагами и другими клетками-продуцентами оксида азота, изменение характера нитроксидергической регуляции после воздействия изучаемого холодового стресса.

Результаты определения иммунологических показателей слюны у 40 студентов-медиков (средний возраст - 20,5 лет), подвергающихся действию психо-эмоционального экзаменационного стресса, приведены в табл. 3.

Определение уровня кортизола в слюне до и после экзамена, проведенное с помощью иммуно-ферментного анализа, показало достоверный трехкратный рост гормона в биологической жидкости, что объективно отражает стресс-индуцированные изменения функции надпочечников при действии психо-эмоционального стресса.

Изменения иммунологических показателей мукозального иммунитета в условиях воздействия психо-эмоционального экзаменационного стресса характеризовались ростом общей гемолитической активности комплемента при снижении активности отдельных компонентов классического пути активации системы (С1-С5), выявленным ростом уровня sFas и существенным снижением количества IL-12 в слюне при высокой степени достоверности полученных результатов (р = 0,001 - 0,005). Изменения уровня метаболитов NO в слюне под влиянием психо-эмоционального стресса представлено в табл. 4. Из табл. 4 следует, что после перенесенного психоэмоционального стресса у обследуемых лиц выявляется с высокой степенью достоверности рост содержания терминальных стабильных метаболитов оксида азота в слюне (NOX, NO2, NO3).

В результате проведенных исследований установлено, что общим для постстрессовых изменений при воздействии холодового и психо-эмоционального стресса является изменения гормональной и нитроксидергической регуляции организма, о чем свидетельствует достоверный и многократный рост уровня кортизола, а также содержания конечных стабильных метаболитов оксида азота в слюне. При действии двух разных по своей природе стрессоров

Таблица 2

Уровень конечных стабильных метаболитов оксида азота в слюне при холодовом воздействии на организм

Показатель	Исходные показатели			После стрессового воздействия		Р
	п	Me	Q25-Q75	Ме	Q25-Q75
NOX мг/л	23	3,82	2,96-4,11	39,2	35,40-85,2	0,005
NO2 мг/л	23	1,01	0,94-1,4	13,1	2,78-21,0	0,005
NO3 мг/л	23	2,42	1,72-3,66	31,8	28,00-34,5	0,005

Таблица 3

Влияние психо-эмоционального стресса на иммунологические показатели слюны

Показатель	До экзамена		После экзамена		Р
	Ме	Q25-Q75	Ме	Q25-Q75
Уровень кортизола, нг/мл	3,2	4-5,6	10,5	9,25-12,25	0,001
Общая активность комплемента (СП 50)	45,6	38,2-48,3	55,4	54,1-57,6	0,003
С1 х 108 эфф. мол/мл	0,134	0,104-0,202	0,119	0,084-0,138	0,006
С2 х 108 эфф. мол/мл	0,132	0,091-0,169	0,089	0,074-0,117	0,005
СЗ х 108 эфф. мол/мл	0,116	0,084-0,147	0,081	0,048-0,108	0,007
С4 х 108 эфф. мол/мл	0,164	0,126-0,199	0,123	0,086-0,153	0,002
С5 х 108 эфф. мол/мл	0,174	0,119-0,208	0,174	0,154-0,191	0,059
sFas	183,7	182,5-23,6	290,5	241,4-444,7	0,005
IL-12	24,82	7,7-28,89	18,4	17,6-18,8	0,003

Таблица 4

Уровень конечных стабильных метаболитов оксида азота в слюне при психо-эмоциональном стрессе

Показатель До экзамена После экзамена Р п Ме Q25-Q75 п Ме Q25-Q75 NOX мг/л 40 2,82 2,40-3,10 20 35,2 24,2-65,4 0,005 NO2 мг/л 40 1,00 1,01-1,3 20 10,1 3,8-24,0 0,005 NO3 мг/л 40 1,82 1,55-2,62 20 25,1 21-27,5 0,005 были установлены также однонаправленные изменения со стороны системы комплемента, в виде снижения активности С1-С5 компонентов в слюне, что, вероятно, отражает формирование стресс-индуцированного катаболического профиля обмена веществ организма.

Вместе с тем выявлены и особенности действия каждого из стрессоров. Так, общая активность системы комплемента после холодового воздействия не меняется, а после психо-эмоцинального стресса с высокой степенью достоверности увеличивается (р = 0,003). После холодового воздействия содержание sFas рецептора в слюне падает на уровне статистически вероятной тенденции, а после психо-эмоционального стресса существенно растет. Можно полагать, что при действии психоэмоционального стресса в нормальных температурных условиях продукция рецептора клетками не меняется, а протеолитическое отщепление мембранных Fas рецепторов происходит весьма активно в связи с усилением процессов катаболизма стресс-индуцированного характера. Разнонаправленные изменения установлены при действии разных стрессов со стороны уровня IL-12 в биологических жидкостях: при холодовом стрессе установлена тенденция роста интерлейкина, а при действии психо-эмоционального стресса - его достоверное снижение. Рост IL-12 при холодовом стрессе можно оценить как адекватную компенсаторную реакцию иммунной системы, способствующую формированию Тх1-зависимого иммунного ответа, обеспечивающего противомикробную устойчивость слизистых оболочек и организма в целом при действии холода. Напротив, падение уровня этого интерлейкина в период действия экзаменационного стресса может отражать снижение противомикробной защиты организма и определять частое развитие у студентов в период экзаменационной сессии снижение противомикробной защиты слизистых оболочек с развитием обострения хронического тонзиллита и других инфекционно-воспалительных заболеваний ЛОР-органов, описанных рядом авторов у студентов в период экзаменационной сессии [4,6].

Таким образом, неинвазивные методы оценки иммунологических показателей слюны являются высокочувствительными и позволяют выявить общие и специфические особенности стресс-индуци- рованных изменений состояния.гормональной регуляции и мукозального звена иммунной системы.

Выводы

• 1.    Установлена возможность выявления стресс-индуцированных изменений гормонального и иммунного гомеостаза с помощью неинвазивных иммунологических методов оценки показателей слюны.

• 2.    Общим для холодового и психоэмоционального стресса является изменения характера гормональной и нитроксидергической регуляции в виде роста уровня кортизола и конечных стабильных метаболитов в слюне, а также однонаправленные изменения (снижение) активности С1-С5 компонентов комплемента.

• 3.    Выявлены особенности действия экстремального холодового и психо-эмоционального стресса на формирование условий для Тх1 поляризации иммунного ответа на мукозо-саливарном уровне в виде статистически вероятной тенденции роста количества IL-12 в слюне при холодовом стрессе и достоверного снижения этого цитокина в слюне под влиянием психоэимоцио-нального стресса.