Нейрогенез в мозге крыс разных возрастных категорий, получавших дозированную физическую нагрузку (экспериментальное и иммуногистохимическое исследование)

Введение. В клинических исследованиях установлено, что физическая активность может быть использована как терапевтическое средство при нейродегенеративных заболеваниях, включая болезнь Паркинсона и болезнь Альцгеймера [1, 2]. В эксперименте продемонстрировано влияние физических упражнений на процессы обучения и памяти, улучшение кровотока в ткани мозга и устойчивости нейронов к травмам, интенсификацию нейрогенеза, в частности, в гиппокампе и моторной коре [3].

Вместе с тем, предполагается, что сохранение таких эффектов, как увеличение скорости походки и восстановление ее ритма у пациентов с болезнью Паркинсона при занятиях на беговой дорожке в течение нескольких недель после окончания упражнений обусловлено скорее изменением нейропластичности, нежели эффективным нейрогенезом [4].

Цель исследования - изучить процессы нейрогенеза в ткани мозга у животных разного возраста при воздействии регулярной дозированной физической нагрузки.

Материал и методы исследования. Исследования выполнены на 80 интактных животных (неинбредных белых крысах). Животные разделены на 4 группы по 20 особей в каждой (10 самцов и 10 самок): молодые (4 мес) – контроль и опыт (дозированная физическая нагрузка), и старые (24-26 мес) – контроль и опыт. Для дозированной физической нагрузки (ДФН) продолжительностью 17 дней, 20 мин/занятие [5] использовали аппаратно-программный комплекс «Ротарод» (ООО «Нейроботикс», 124498 Москва, Зеленоград, 2013). Эксперименты проведены в соответствие с Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств Минздрава и социального развития РФ (2012 г.), с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Минздрава СССР от 12.08.1977 г. №755). Материал для исследования получали от животных после завершения поведенческой части исследования - спустя 21 день от начала эксперимента.

Анализ моторной коры (FrPaM) проводили на уровне (-0,3)-(-3,3) мм, структур гиппокампа - (-2,8)-(-3,8) мм от брегмы [6]; при микроскопии препаратов в гиппокампе выделяли 4 области - поля гиппокампа – СА1, СА2, СА3, СА4 [7]. С целью изучения нейрогенеза у животных разного возраста при физической нагрузке проведено иммуногистохимическое исследование гиппокампов с использованием антител к белкам GFAP (Monoclonal Mouse Antibody; Clone GA5, Diagnostic BioSystems, USA), CD56 – NCAM (123C3.D5; Mouse Monoclonal Antibody; The Hague, Netherlands) и Cyclin D1 (Rabbit Monoclonal Antibody; Clone SP4; LabVision Corporation, USA). При выполнении иммуногистохимических исследований применяли универсальный иммунопероксидазный метод с использованием полимерной системы детекции «Histofine» (Япония; «Микротесты»). Статистическая обработка полученных данных проводилась вычислением критерия х2 с использованием программы Biostat.

Результаты исследования и их обсуждение. При проведении иммуногистохимических исследований экспрессия GFAP определялась у молодых животных контрольной и опытной группы в зрелых астроцитах мозга, в том числе, локализованных в гиппокампе, двигательной коре и зубчатой фасции (рис. 1).

Клетки эпендимы в группе контроля были иммунопозитивны в отношении циклина у 60%

Рис. 1. Экспрессия GFAP в астроцитах зубчатой фасции в мозге молодой самки контрольной группы. Ув. 600.

Рис. 2. Экспрессия циклина в ядрах клеток в субэпендимной области СВЗ молодой самки контрольной группы. Ув. 600.

Рис. 3. Экспрессия GFAP в астроцитах зубчатой фасции старой самки крысы контрольной группы. Ув. 600.

Рис. 4. Отдельные GFAP-позитивные клетки в эпендиме желудочка старого самца крысы, получавшего физическую нагрузку. Ув. 600.

самок. У всех животных, как группы контроля, так и у животных, получавших дозированную физическую нагрузку (100%; самцов и самок) отдельные иммунопозитивные к циклину ядра выявляли в субэпендимной области (рис. 2) и моторном поле коры головного мозга (FrPam). Также в опытной группе положительную реакцию на циклин наблюдали во всех полях гиппокампа у 40% самок.

У всех молодых самцов и самок во всех экспериментальных группах в субэпендимной области визуализировались единичные NCAM окрашенные клетки (100%; самцы и самки). Кроме того слабоположительную реакцию на NCAM выявляли в гиппокампах всех самок после дозированной физической нагрузки, преимущественно в поле СА4.

Таким образом, у молодых животных группы контроля отмечается неинтенсивный нейрогенез в субэпендимной области и эпендиме; в то время как у молодых животных, получавших дозированную физическую нагрузку, нейрогенез, судя по экспрессии циклина и CD56, отмечался не только в субэпендимной области, но и у самок – в гиппокампе. То есть, у молодых животных контрольной и опытной групп наблюдались одни и те же закономерности – новообразованные клетки выявлены преимущественно в субэпендимной области, что не противоречит существующим представлениям, учитывая возраст животных [8].

При микроскопии гиппокампа старых животных во всех экспериментальных группах экспрессия GFAP определялась в астроцитах мозга (рис. 3). Единичные окрашенные клетки морфологически не относящихся к астроцитам были выявлены в эпендиме и субэпендимной области (рис. 4).

Экспрессия циклина. В ткани мозга старых животных выявлялась слабоинтенсивная экспрессия в эпендиме у самок как в контрольной, так и в опытной группах. Во всех экспериментальных группах у 100% животных экспрессию умеренной интенсивности мы наблюдали в субэпендимной области и в моторном поле коры. Также, выраженную экспрессию отмечали у всех животных во всех полях гиппокампа, слабоинтенсивную в зубчатой фасции у 50% самцов контрольный группы и 80% самок, получавших физическую нагрузку.

Экспрессия CD56 (NCAM). Единичные окрашенные клетки мы наблюдали только у самок обеих групп в субэпендимной области и в эпендиме в опытной группе.

Таким образом, у старых животных, получавших дозированную физическую нагрузку, образование новых клеток отмечается в субэпендимной области, у всех животных, как у самцов, так и самок, о чем свидетельствуют результаты исследования экспрессии циклина. В эпендиме экспрессия циклина выявлена только у самок. Вместе с тем, экспрессия CD56 выявлена в эпендиме и субэпендимной области у ограниченного числа особей (самки), а экспрессия GFAP выявлена в субэпендимной области в клетках, морфологически не относящихся к астроцитам, у всех животных. Также в зубчатой фасции и гиппокампе в этой экспериментальной группе отмечалась экспрессия циклина, без экспрессии NCAM.

Согласно литературным данным, находящиеся в субвентрикулярной и субгранулярной зонах нейральные стволовые клетки (НСК) являются прямыми потомками фетальных астроцитобластов, и, также как последние, характеризуются наличием в цитоплазме специфических фибриллярных белков класса III – нестина, GFAP и ви-ментина, а также экспрессией ядерных факторов транскрипции Sox1, Sox2 и Musashi-1 [9]. Кроме того, экспрессия GFAP характерна для НСК на продвинутых стадиях нейрогенеза [10, 11]. Соответственно, экспрессия GFAP недифференцированными клетками, не относящимися морфологически к астроцитам, может трактоваться (при наличии экспрессии циклина) как маркер нейрогенеза в этих зонах. Известно также, что для нейробластов характерна экспрессия NCAM и даблкортина [9], поэтому, учитывая также ранее приведенные сведения, клетки СВЗ и СГЗ, дающие экспрессию на GFAP и Cyclin D1, могут быть отнесены нами не к нейробластам, а к НСК, а экспрессирующие Cyclin D1 и CD56 (NCAM) – к нейробластам.

То есть, у старых животных, получавших физическую нагрузку, выявлен нейрогенез в субэпендимной области и у самок также в эпендиме и в пролиферативной зоне гиппокампа. Вместе с тем, нельзя исключать в этих возрастных группах и, преимущественно, в группе контроля того, что часть новообразованных клеток дифференцируется в сторону глиального фенотипа, о чем свидетельствует интенсивная экспрессия GFAP, не сопровождающаяся экспрессией NCAM (CD56).

Известно, что возрастные процессы в мозге сопровождаются ослаблением нейрогенеза и проявляется это уменьшением числа нейрональных предшественников, снижением их пролиферативной активности, удлинением клеточного цикла трансформации, нарушением пропорции выживших клеток к общему числу трансформирующихся нейробластов, дифференцировкой клеток преимущественно в сторону глиального фенотипа [12]. С другой стороны, скорость нейрогенеза в зубчатой извилине гиппокампа и в субвентрикулярной зоне модулируется различными стимулами окружающей среды, в частности, физическая нагрузка активирует нейрогенез в зубчатой извилине [12].

Таким образом, в наших исследованиях установлено, что нейрогенез как у старых, так и у моло- дых животных стимулируется дозированной физической нагрузкой, в большей степени – у самок. У молодых животных контрольной группы и группы, получавшей дозированную физическую нагрузку, нейрогенез отмечался в субэпендимной области, при физической нагрузке – и в гиппокампе (у самок). У старых животных контрольной группы нейрогенез выявлен в субэпендимной области у небольшого количества самок. У старых животных, получавших дозированную физическую нагрузку, образование новых нервных клеток выявлено в субэпендимной области – у всех животных, как у самцов, так и самок, а также в эпендиме – у самок.

При этом у старых животных определенная часть новообразованных клеток (в зубчатой фасции и гиппокампе), по-видимому, все же дифференцируется в направлении глиального фенотипа.