Нейроморфологические и молекулярные эффекты этанола

Проблемы развития центральной нервной системы (ЦНС) человека в ранний онтогенетический период, когда формируются основные структурные и функциональные констелляции, присущие зрелому мозгу, остаются актуальными на протяжении многих, в том числе и последних лет. Эмбриогенез может быть осложнён разнообразными отклонениями в реализации программы развития организма, которые сказываются на формировании мозга, приводят к появлению многочисленных уродств и психических заболеваний [1].

Возникновение таких заболеваний может быть обусловлено различными экзогенными факторами: загрязнением окружающей среды, повышением радиационного фона, гипоксией, аддикцией родителей, в особенности злоупотреблением психоактивными веществами и алкоголем [2]. Среди последствий поражений ЦНС у детей, матери которых зависимы от алкоголя, наиболее серьезными являются недоразвитие целого мозга – анэнцефалия, или его отделов (конечного, промежуточного, среднего), микроцефалия, гидроцефалия, гетеротопия, порэнцефалия, умственная отсталость, алкогольный синдром плода (АСП), а также различной степени выраженности алкогольные эффекты АСП [3, 4, 5, 6]. Изучение эффектов этанола на молекулярном уровне позволяет лучше понять механизмы, приводящие к таким серьезным последствиям алкоголизации будущих матерей.

Целью настоящего исследования явилось изучение влияния алкоголя на головной мозг эмбрионов и плодов человека и на биомлекулы крови.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Для выяснения влияния алкоголя изучался головной мозг эмбрионов и плодов человека 7–12 недель развития, которые были получены в соответствии с требованиями этического комитета с согласия пациенток, в процессе проведения операций по прерыванию беременности. Всего было получено 56 эмбрио- нов, из них 23 – от больных алкоголизмом женщин (основная группа) и 33 – от здоровых женщин (контрольная группа). Возраст больных алкоголизмом составлял 26–39 лет, длительность заболевания варьировала от 3 до 13 лет. Во всех случаях была диагностирована II стадия алкоголизма (F10.201, F10.202 по МКБ-10). Диагноз установлен в результате клинического обследования сотрудниками отделения аддик-тивных состояний НИИ психического здоровья. В контрольную группу вошли эмбрионы и плоды от здоровых женщин, не имевших неврологических и психических заболеваний в анамнезе. Женщины контрольной группы были сопоставимы по возрасту с больными алкоголизмом.

Головной мозг эмбрионов и плодов фиксировали в 0,5%-ном растворе глутаральдегида на фосфатном буфере с концентрацией 0,1 моль, рН=7,3–7,4. Кусочки мозга размером 1 мм³ дофиксировали в 1%-ном растворе OsO 4 на том же буфере в течение 1 часа, затем дегидратировали в спиртах возрастающей концентрации и заливали в аралдит. Ультратонкие срезы изготавливали на ультратоме «Ultracut-E» (Австрия), контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца по Рейнольдсу и просматривали в электронных микроскопах JEM-100B и JEM-100CX (Jeol, Япония), Philips 211 (Нидерланды), световом микроскопе Axioscop A1 (Carl Zeiss, Германия).

В опытах in vitro кровь здоровых доноров инкубировали с этанолом в концентрации 0,5% при 37ºС. Из проб отбирали аликвоты через 0, 1, 2 и 3 часа, центрифугировали 10 минут при 3000 об/мин для получения плазмы. В плазме определяли содержание продуктов окислительной модификации белков (измеряя карбо-нилированные белки по реакции с 2,4-динитрофенилгидразином) и продуктов перекисного окисления липидов с использованием тиобарбитуро-вой кислоты (ТБК-реактивные продукты). Для измерения оптической плотности проб использовали прибор Epoch (BioTek, США).

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью пакета компьютерных программ «Statistica», версия 10 для Windows. Данные представляли в виде M±m, где M – среднее значение, m – стандартная ошибка среднего значения. Статистически значимыми считали различия при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В работе установлены морфометрические, структурные и ультраструктурные закономерности воздействия пренатально поступающего алкоголя на формирование корковой пластинки, нейробластов, глиобластов, перицитов, эндотелия капилляров, синаптических соединений и в целом на васкуляризацию развивающегося мозга.

Особенностями развития корковой пластинки мозга являлись появление в её структуре избыточной складчатости, нарушения локализации групп нейронов, наличие участков с повреждёнными микромодулями, формирование ниш и участков выпадения нейронов при стратификации в период с 8 до 12 недель развития. Дальнейшие исследования плодов более поздних стадий развития (до 42 недель) при пренатальной гипоксии позволили установить, что многие из описанных патологических проявлений, обнаруженных при действии алкоголя, имеют сходство с таковыми при гипоксии. Причём указанные изменения в структуре коры мозга сохраняются продолжительное время, создавая проблемы формированию психики и интеллекта [7].

Характерными проявлениями воздействия алкоголя на развивающиеся нервные и глиальные клетки коры явились наличие повреждений в структуре внутриклеточных мембранных органелл, таких как митохондрии, лизосомы, комплекс Гольджи, ЭПР, ядерная мембрана. В целом отмечались реактивные изменения нейробластов и глиобластов с увеличением активности процесса аутофагии, заключающиеся в появлении многочисленных мультивезикулярных и мембранных телец, аутофагосом, а также особенностях мембран ядерной оболочки. Установлено более частое, чем в контроле (p<0,001), появление структур, содержащих ядерный материал вблизи наружной и внутренней оболочек кариолеммы – микроядер, что свидетельствует об активации системы апоптоза в дополнение к аутофагии.

Влияние этанола на мембраны выражалось и в его воздействии на синаптические контакты между формирующимися нейронами в основной группе исследования на 9–12 неделях развития, что выражалось в замедлении развития синапсов, снижении длины постсинаптических уплотнений, уменьшении периметра и площади пресинаптической терминали.

Результаты исследования структурно-функциональных особенностей мембран клеток мозга и крови у больных алкогольной зависимостью свидетельствуют о значительной роли мембран в реализации эффектов этанола на клетку [8]. В этой связи были проведены специальные исследования, посвященные изучению эффектов этанола на биологические мембраны и их структурные компоненты (белки и липиды) [9,

10]. Изучение эффектов этанола на молекулярном уровне важно для понимания патогенетических механизмов, лежащих в основе формирования алкогольной зависимости, без чего, в свою очередь, невозможно дальнейшее развитие в направлении повышения эффективности терапии данного заболевания, а также разработки реабилитационных и профилактических программ, отвечающих современным требованиям.

Согласно данным литературы, формирование алкогольной зависимости сопровождается нарушениями в функционировании практически всех систем организма, в том числе страдают нервная [6], эндокринная [11], иммунная [12] системы, нарушается водноэлектролитный баланс [13], наблюдается резкая диспропорция в окислительно-восстановительных процессах, часто в организме больного алкоголизмом выявляется состояние окислительного стресса [14, 15, 16, 17]. Существующий на данный момент технический уровень исследований позволяет проводить оценку токсических эффектов этанола на тонком молекулярном уровне.

Изучение патогенетических механизмов, обусловливающих токсические эффекты этанола, весьма разнообразны. Известно, что существенную роль играют мембрано- и синаптотропные свойства этанола, связанные с его действием на ионный транспорт и медиаторные системы биологических мембран [9, 11, 18]. Этанол способен нарушать структуру и физические свойства фосфолипидного бислоя, что не может не отражаться на функционировании практически всех мембранных систем. Кроме того, этанол, как и его основной метаболит ацетальдегид, обладает выраженным токсическим действием непосредственно на биомолекулы [10]. Для изучения мембранотропных эффектов этанола нами были проведены специальные исследования, которые систематизированы в работах [9, 19], где основные эффекты этанола и его метаболитов были изучены на эритроцитах и их тенях, используемых в качестве универсальной модели биологической мембраны. Было доказано, что этанол и его метаболиты – ацетальдегид и этиловые эфиры жирных кислот – способны индуцировать изменения структурно-функциональных характеристик эритроцитов. Более детальные исследования изменения белковой и липидной компонент мембран эритроцитов под действием этанола и ацетальдегида показали, что этанол снижает микровязкость гидрофобной области липидного бислоя эритроцитов, при этом модификации мембранных белков и белков цитоскелета не происходит. Ацетальдегид, помимо повреждения гидрофобной области липидного матрикса, приводит и к окислительной модификации эритроцитарных белков. Продукты неокислительного превращения этанола в организме – этиловые эфиры жирных кислот – в экспериментах in vitro встраивались в мембраны эритроцитов, снижая стабильность клеток.

Кроме структурно-функциональных нарушений биологических мембран, при алкоголизме происходит модификация сывороточных биомолекул. В наших исследованиях одним из направлений было изучение способности этанола осуществлять окислительную модификацию молекул белков и липидов плазмы крови in vitro [10].

Обнаружено, что в контрольных пробах (при инкубации крови без этанола) через 1 и 2 часа инкубации статистически значимых изменений в уровне карбони-лированных белков в плазме крови не происходит. Через 3 часа инкубации содержание карбонилов белков в плазме относительно 0 часов инкубации достоверно повышается (0 часов: 0,27±0,01 нмоль/мг белка; 3 часа: 0,31±0,01 нмоль/мг, р<0,05), что свидетельствует о спонтанном окислении белков плазмы крови. Содержание ТБК-реактивных продуктов в контрольных образцах без этанола достоверно превышает исходный уровень уже через 2 часа инкубации, а через 3 часа происходит их дальнейший рост (0 часов: 2,50±0,10 нмоль/мл, через 2 часа: 2,65±0,11 нмоль/мл, через 3 часа: 2,73±0,10 нмоль/мл, р<0,05 по сравнению с показаниями в 0 часов инкубации в обоих случаях), что говорит о спонтанном окислении липидов в плазме крови. Таким образом, при 37ºС спонтанному окислению подвергаются как белки, так и липиды плазмы крови. Окисление липидов идёт быстрее, чем окисление белков.

В присутствии 0,5% этанола сразу (в 0 часов инкубации) наблюдается достоверный рост карбонилиро-ванных белков (0,32±0,02 нмоль/мг, р<0,01). Через 1 час инкубации уровень карбонилов стабилизируется, оставаясь повышенным относительно контрольных значений (через 1 час и 3 часа инкубации: 0,35±0,02 нмоль/мг, р<0,01 по сравнению с показателями в 0 часов). То есть этанол индуцирует окислительную модификацию белковых молекул плазмы крови. Уровень ТБК-реактивных продуктов в плазме в присутствии 0,5% этанола по мере увеличения времени инкубации статистически значимо увеличивается (0 часов: 2,86±0,14 нмоль/мл; 1 час: 3,31±0,06 нмоль/мл; 2 часа: 3,36±0,10 нмоль/мл; 3 часа: 3,45±0,09 нмоль/мл; р<0,05 как по сравнению с соответствующими контрольными значениями, так и по сравнению с показанием в 0 часов инкубации). То есть этанол индуцирует окислительную модификацию липидов плазмы крови.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, одним из механизмов токсических эффектов алкоголя при нейрогенезе может быть эта-нол-индуцируемая окислительная модификация как белковых, так и липидных молекул. В настоящее время нами проводятся исследования, направленные на изучение эффектов этанола на уровень продуктов окислительной модификации молекул ДНК в плазме крови. Также ведется поиск веществ, способных защитить биомолекулы плазмы крови от токсического действия этанола и его метаболитов. В дальнейшем наиболее перспективные вещества могут быть рекомендованы для создания на их основе препаратов, которые будут эффективны в клинике алкоголизма.