Нейропаралитический эффект экстрактов из морских червей типа Nemertea: направленный скрининг веществ антиболевого действия

от боли в глобальном масштабе, и диагноз хронической боли каждый год впервые ставят 10% новым пациентам. Таким образом, существует очевидная необходимость в поиске и разработке новых анальгетиков и анестетиков.

Одним из важных направлений в разработке обезболивающих препаратов длительного действия являются нейротоксины, частично или полностью подавляющие проведение нервного импульса. Среди известных ядов нервнопаралитического действия самым мощным природным нейротоксином является тетродотоксин (ТТХ). Из-за высокой частоты пищевых отравлений с последующим летальным исходом этот яд лучше всего изучен в рыбах фугу, но также найден в самых разнообразных организмах: в том числе в нескольких видах плоских червей, морских звезд, сине-кольчатых осьминогах, брюхоногих моллюсках, и даже в позвоночных, таких как Калифорнийский тритон и морской бычок [4]. Наиболее перспективными объектами для изучения тетро-дотоксина являются представители типа Nemertea, которые содержат экстремально высокое количество токсина, сами резистентны к нему, и используют токсин не только в качестве защиты, но и для нападения на жертву в качестве яда нервнопаралитического действия.

Цель работы: провести скриниг на наличие нейротоксинов из экстрактов тканей разных видов немертин, обитающих в прибрежных зонах Японского моря: Cephalothrix simula, Lineus alborostratus, Quasitetrastemma stimpsoni и Quasitetrastemma nigrifrons.

Материал и методика. Образцы четырех видов немертин - Cephalothrix simula, Lineus alborostratus, Quasitetrastemma stimpsoni, и Quasitetrastemma nigrifrons были собраны в ризоидах бурых водорослей Saccharina sp. в заливе Восток залива Петра Великого (Японское море) в июне-августе 2015 г. (табл. 1). Токсины выделяли методом, в основе которого лежала экстракция раствором уксусной кислоты [6]. Образцы промывали 3 раза стерильной морской водой, затем помещали в ручной гомогенизатор (EMS, USA) для тщательной гомогенизации тканей. В гомогенат добавляли 1% раствор уксусной кислоты в 80% метаноле до соотношения гомогенат :

экстрагент - 1:10. Суспензию помещали в ультразвуковой гомогенизатор (HD 2070, Bandelin Sonopuls, Germany) и производили дальнейшее разрушение тканей в течение 30 минут (20 kHz, амплитуда 228 мкм, рабочий цикл 0,8 секунд интервалом 0,2 секунды), а затем оставляли на кипящей водяной бане на 20 минут. Полученный экстракт центрифугировали в течение 10 мин при 10000 g, отбирали супернатант и упаривали в роторном испарителе до объема 20-100 мкл. Остаток восстанавливали 0,1% водным раствором уксусной кислоты до 1 мл.

Таблица 1. Токсичность немертин, собранных в заливе Восток залива Петра Великого (Японское море).

Примечание: + - ярко выраженная токсичность; ± - невыраженная токсичность; - токсичность не выяв- лена

Биологическую оценку токсичности производили при внутрибрюшинном введении экстракта на 25 мышах-самцах линии С57BL6, массой 18-20 гр., получавших стандартную виварную диету [3]. Контрольным животным вводили растворитель (0,1% раствор уксусной кислоты). Степень полученного токсического эффекта оценивалась по степени выраженности токсических симптомов.

Проводниковую анестезию исследовали в опытах на седалищном нерве лягушек Rana chensinensis [1]. О степени обезболивания судили по отсутствию сгибания конечности, раздражаемой 0,3% раствором серной кислоты. Изучение свойств центральной нервной системы проводили на препаратах лягушек, использовали спинальную лягушку с разрушенным головным мозгом и сохраненным спинным. Приготовление спинальной лягушки осуществляли посредством ее декапитации, затем лягушку подвешивали на штативе, приколов нижнюю челюсть булавкой к пробке штатива. Ожидали, пока у лягушки пройдет болевой шок (послеоперационное угнетение спинного мозга), в это время смачивали кожу лягушки водой для усиления кожного дыхания. При исследовании проводниковой анестезии определяли время рефлекса, для этого погружали кончики пальцев одной из лапок лягушки в стаканчик с 0,3% раствором серной кислоты, фиксировали время от момента погружения лапки в кислоту до появления ответной реакции на раздражение. Таким образом, определяли время рефлекса в секундах. Повторяли определение времени рефлекса 2–3 раза, после каждого раздражения обмывали лапку водой. Повторное определение проводили через 2–3 мин. Подсчитывали среднее время рефлекса. При исследовании местноанестезирующего действия в качестве препарата сравнения был взят новокаин (Борисовский ЗМП, Беларусь).

Результаты. Наибольшая токсичность была выявлена в экстракте из C. simula: экстракт из 60 мг тканей цефалотрикса вызывал у животных паралич, судороги, нарушение дыхания (одышка) и затем летальный исход в течение 4 минут.

Экстракт из L. alborostratus вызывал генерализованные тонико-клонические судороги с летальным исходом в течение часа. Тонические судороги возникали чаще и длились продолжительнее, они затрагивали мышцы мордочки, шеи, туловища, лапок. Задние лапы разогнуты, передние лапы согнуты, мышцы напряжены, голова опрокинута назад, туловище вытянуто, зубы сжаты, сознание сохранено, при этом дыхание не нарушено. Тонические судороги сменялись фазой клонических судорог: животное вытягивало задние лапы, и возникали быстрые мышечные сокращения, следующие друг за другом, при этом наблюдались нарушение дыхательного цикла и непроизвольные акты мочеиспускания.

Экстракт из Q. nigrifrons показал краткосрочный нейротоксический эффект: животные активны, поведение обычное. У мышей наблюдается частичный парез задних лапок. Возможно, вследствие токсического воздействия на поясничный отдел спинного мозга. При этом наблюдалось затруднение в передвижении, а именно -животные не могли приподнять живот вследствие слабости мышц бедра и поясничного отдела позвоночника.

Экстракт из Q. stimpsoni не проявил токсического эффекта. Животные активны, видимых отклонений в поведении и двигательной сфере не было зафиксировано.

Проводниковая анестезия на седалищном нерве лягушки показала, что обезболивающим действием обладали экстракты из С. simula и L. alborostratus (табл. 2). Экстракты из Q. nigrifrons и Q. stimpsoni не проявляли подобного действия. Так, в условиях проводниковой анестезии время наступления обезболивающего эффекта под влиянием экстракта из С. simula составляла 7,2 мин, а экстракта из L. alborostratus - 20 мин. В сопоставлении с препаратом сравнения (новокаин) время наступления обезболивающего эффекта под влиянием экстракта из С. simula короче, а под влиянием экстракта из L. alborostratus - длиннее.

Продолжительность анестезии из экстрактов С. simula и L. alborostratus на данной модели проводникового обезболивания проследить не представилось возможным, так как анестезирующий эффект не прекращался за весь период наблюдения.

Одновременно с анестезирующим эффектом у животных после нанесения веществ развивалось снижение мышечного тонуса. Время наступления и продолжительность атонии совпали с анестезией при использовании экстрактов из C. simula и L. alborostratus (табл. 2). Восстановление двигательной активности и чувствительности происходило только в опытах с применением раствора новокаина и экстракта L. alborostratus . Экстаркты из С. simula приводили к полному подавлению двигательной активности и болевой чувствительности в течение всего периода наблюдения (более 60 минут).

Экстракты из Q. nigrifrons и Q. stimpsoni не вызывали атонии и проводниковой анестезии в эксперименте на седалищном нерве лягушек.

Таблица 2. Сравнительная характеристика биологических эффектов в опытах на седалищном нерве лягушек Rana chensinensis

Примечание: — эффект не возникал за весь период наблюдения (60 минут)

Обсуждение. К сожалению, сложность структуры нейротоксинов превышает разрешающую способность химических методов. Сведения об особенностях фармакологического эффекта дают дополнительную информацию о строении активного центра молекулы токсина. При биологической оценке токсического действия экстрактов, экстракт из цефалоткиса проявил типичные симптомы интоксикации тетродоток-сином [7]: затрудненное дыхание, судороги и летальный исход в течение 4 мин. Таким образом, экстракт из С. simula содержит экстремально высокое количество токсина (табл. 1) и является перспективным объектом для изучения в качестве источника тетродотоксина - перспективного анестетика и антиаритмика. Описанные токсические проявления, возникшие у экспериментальных животных, развились вследствие нарушения деятельности ЦНС. Согласно описанным проявлениям яд увеличивает частоту нервных импульсов в мышечной ткани, что приводит к судорогам у мышей. В результате поиска анестезирующей активности среди экстрактов немертин установлено, что анестезирующим действием обладают 2 экстракта: из C. simula и L. alborostratus. Они индуцировали выраженное обезболивающее действие в условиях проводниковой анестезии. Экстракты из Q. nigrifrons и Q. stimpsoni не вызывали фармакологических эффектов, а значит в экстрактах отсутствовало достаточное количество токсинов, приводящих к видимым нейротоксическим и анестезиологическим эффектам. Стоит отметить, что Aсакава и соавторы (2013) также показали отсутствие токсина у представителей рода Quasitetrastemma, выловленных в заливе Аккеши (Японское море) [2].

Выводы: экстракты из C. simula и L. alborostratus могут быть рекомендованы к дальнейшим исследованиям: очистке, выделению чистых соединений и доклиническому изучению анестезирующей активности.

Исследование выполнено при поддержке ДВФУ, проект №14-08-06-19_и. Работа поддержана грантом Программы фундаментальных научных исследований «Дальний Восток» №15-I-7-022 и 15-II-6-074.