Нейропротекторный эффект эритропоэтина при экспериментальной ишемии головного мозга

Введение. Эритропоэтин (ЭПО), прежде всего, известен как фактор, стимулирующий образование эритроцитов de novo, благодаря пионерской работе P. Carnot et al., опубликованной в 1906 г., в которой блестяще продемонстрировано, что плазма крови экспериментальных животных после кровопотери содержит фактор, вызывающий ретикулоцитоз у интактных животных [5]. После выделения чистого ЭПО, идентификации его структуры, клонирования гена для клинического использования было налажено промышленное производство рекомбинантного человеческого ЭПО, который можно отнести к одним из самых успешных препаратов за весь период использования технологий рекомбинантной ДНК [15]. ЭПО имеет молекулярную массу

30,4 кДа, его молекула состоит из 165 аминокислот и 4 углеводных цепей, необходимых для стабилизации структуры, защиты от деградации свободными радикалами, температурой, реализации биологической активности [23]. Важное значение имеют 2 дисульфидные связи между остатками цистеина в положениях 7 и 160, 29 и 33. Период полураспада ЭПО после поступления в кровь составляет 5–6 ч. В основном ЭПО синтезируется перитубулярными и тубулярными клетками почек, где в ответ на гипоксию экспрессируется ген ЭПО при участии гипоксия-индуцируемого фактора-1 [10]. ЭПО также может синтезироваться нейронами, клетками микроглии, гепатоцитами, клетками Купфера, клетками эндометрия, эндотелиальными клетками, кардио- миоцитами, инсулин-продуцирующими клетками [8]. Внепочечный ЭПО является низко-сиалированным с более коротким периодом полужизни, а его эффект, прежде всего, проявляется на ауто- и паракринном уровнях [2].

Результаты оценки эффектов ЭПО на молекулярном уровне позволяют отнести его одновременно к гормонам, факторам роста и цитокинам. Основной мишенью для ЭПО являются бурст- и колониеобразующие единицы гра-нулоцитарно-моноцитарно-мегакариоцитарно-эритроцитарные, эритроцитарные, а также эритробласты и пронормобласты, в которых он отвечает за пролиферацию, дифференцировку, угнетение апоптоза [6]. Открытие рецепторов для ЭПО на клетках неэритроидных тканей, таких как нейроны, кардиомиоциты, клетки почек, эндотелиоциты, лимфоциты, моноциты, макрофаги и др., позволило обнаружить новые неэритроидные эффекты ЭПО, сам ЭПО стал рассматриваться в роли плейо-тропного регулятора гомеостаза и как звено неспецифической защиты при повреждении, а рецепторы ЭПО на неэритроидных клетках обозначаются как защищающие ткань рецепторы (TPR) [1]. Строение TPR отличается от рецептора ЭПО на эритроидных клетках, для его активации требуются меньшие концентрации ЭПO [13]. TPR состоит из субъединиц рецептора ЭПО и βCR (общий рецептор β, CD131), последний также представлен в составе рецепторов для ГМ-КСФ, ИЛ-3, ИЛ-5.

В последние годы внимание многих исследователей сосредоточено на плейотропных эффектах ЭПО [12]. В частности, продемонстрировано влияние ЭПО на тонус и репарацию сосудов, кардиомиоцитов, нефроэпителиоци-тов, активацию эндотелиоцитов, сократительную способность миокарда, тромбоцитопоэз, лейкопоэз, систему гемостаза, иммунный статус и др. [7, 28, 29, 30]. Особого внимания заслуживают нейротропные эффекты ЭПО [3, 16, 18]. В головном мозге у плода обнаружены ЭПО и его рецептор, а их дефицит приводит к нарушению эмбриогенеза мозга, активации апоптоза нейронов. Увеличение концентрации ЭПО в амниотической жидкости при гипоксии плода оказывает нейропротекторный эффект, снижает повреждение клеток сетчатки. Применение ЭПО в эксперименте восстанавливает когнитивную функцию и препятствует атрофии мозга при сотрясении мозга, аутоиммунном энцефаломиелите. Ранее нами показано позитивное влияние ЭПО на аффектив- ный и психофизиологический статус, состояние вегетативной нервной системы у больных ХПН, находящихся на гемодиализе [27].

Ишемический инсульт является самым распространенным (80 % случаев) видом инсульта и возникает в результате критического снижения мозгового кровотока – менее 8 мл / 100 г / мин. Снижение мозгового кровотока до 20 мл / 100 г / мин приводит к дисфункции нейронов при сохранной жизнеспособности – это область пенумбры (полутени), где деполяризация и гибель клеток наступает примерно через 80 мин. Дальнейшее снижение мозгового кровотока до 18 мл / 100 г / мин запускает метаболический каскад, ведущий к повышению уровня эксайтотоксичных нейротрансмиттеров, нарушению функции ионных насосов, синтезу свободных радикалов и простагландинов, внутриклеточному накоплению Ca²+ и гибели клеток уже через 40 мин. При полном отсутствии церебрального кровотока разрушение клеток коры больших полушарий наступает примерно через 4 мин. Таким образом, в результате ишемического инсульта формируется центральное, необратимо пораженное ядро инфаркта и потенциально обратимая зона ишемической полутени, которая является мишенью для терапии. Помимо максимально раннего восстановления мозгового кровотока, которое достигается различными реперфузионными методами, патогенетически обоснованным методом терапевтического воздействия при ишемическом инсульте является предотвращение разрушения мембран нейронов в области пенумбры и обеспечение адекватной доставки О 2 в ишемизированную ткань. В этом отношении неподдельный интерес вызывает ЭПО.

Цель работы – исследовать влияние ЭПО на неврологический статус, микроциркуляцию и морфологию очага повреждения при экспериментальной ишемии головного мозга.

Материал и методы исследования. Работа выполнена на 70 беспородных половозрелых крысах обоего пола массой 220–250 г. Животные находились в стандартных условиях вивария на типовом рационе в соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (ETSIN 123, 18 марта 1986 г.), включая приложение А от 15.06.2006, с Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и совета Европейского союза по охране животных, используе- мых в научных целях от 22.09.2010 г. Оперативные вмешательства проводились в экспериментальной операционной с соблюдением правил асептики и антисептики под внутримышечным обезболиванием препаратом «Зо-летил-100» (Virbac «Sante Animale», Фpaнция) в дозе 2 мг/кг массы. Все животные были случайным образом разделены на три группы: группа 1 (n = 10) – ложнооперированные животные, у которых проводили трепанацию черепа и вскрытие твердой мозговой оболочки без диатермокоагуляции пиальных сосудов (ложнооперированные животные); группа 2 (n = 30) – модель ишемии коры головного мозга (ИКГМ) создавали путем диатермокоагуляции пиальных сосудов коры головного мозга в сенсомоторной зоне; группа 3 (n = 30) – животные, у которых на фоне ИКГМ применяли ЭПО. ЭПО («Эпокрин», ФГУП «Гос. НИИ ОЧБ» ФМБА России, Санкт-Петербург) вводили внутрибрюшинно через 3, 24 и 48 ч от индукции ИКГМ в разовой дозе 5000 МЕ/кг, суммарная доза 15000 МЕ/кг. Второй группе животных вводили эквиобъемное количество физиологического раствора. Выведение животных из эксперимента осуществлялось путём внутрисердечного введения 3 мл 7,5 % раствора хлористого калия (ООО «Фармлэнд» Республика Беларусь).

Неврологический статус у крыс исследовали с использованием шкалы J.H. Garcia и оценкой следующих параметров: спонтанная активность в клетке за 5 мин; симметричность вытягивания передних конечностей; симметричность движений; способность забираться по стенке проволочной клетки; реакция на прикосновение к каждой стороне туловища; ответ на прикосновение к вибриссам. Максимальный неврологический дефицит – 3 балла, его полное отсутствие – 18 баллов. Для оценки микроциркуляции применялся прибор «ЛАКК-01» (Россия) на основе инфракрасного лазера с трехканальным световым зондом, смонтированным из кварцевых моноволокон-ных световодов. Показатели снимались в течение 5 мин через трепанационное отверстие с помощью датчика, приложенного к месту операции. Математическая и статистическая обработка показателей прибора осуществлялась с помощью комплекта программ ООО «Лазма» (Россия) и расчетом показателя микроциркуляции (ПМ), который является функцией от усредненной скорости эритроцитов (V ср) и концентрации эритроцитов в зонди- руемом объеме тканей (Nэр), зависящей от показателя гематокрита и количества функционирующих сосудов: ПМ = Nэр + Vср. Величина ПМ измерялась в относительных перфузионных единицах (пф. ед.). После выведения животных из эксперимента извлекался головной мозг, производилась его макроскопическая оценка, фрагменты окрашивались гематоксилином и эозином для обзорной микроскопии по методу Бильшовского – для выявления миелиновых волокон, по методу Ниссля – для верификации тигроидного вещества Ниссля. Микропрепараты исследовали на микроскопе «Leica DMRXA» (Германия) с помощью компьютерной программы анализа цветового изображения «ДиаМорф Cito-W» (Россия) при увеличении микроскопа × 400, в 10 случайно отобранных полях зрения на условной единице площади оценивали: количество неизменённых нейронов; количество нейронов с хроматолизом; количество клеток-теней; количество мелких кровеносных сосудов (капилляров, артериол). Оценку неврологического статуса проводили на 1, 3, 7, 14, 30 сутки, микроциркуляцию и морфологию очага повреждения – на 7, 14 и 30 сутки после индукции ИКГМ. Статистическая обработка результатов проводилась с помощью пакета прикладных программ SPSS Statistics 19. Показатели обрабатывались методами описательной статистики и представлены в виде медианы (Ме) и квартилей [Q1–Q3]. Значимость различий между группами оценивали при помощи непараметрического критерия Крускалла–Уолиса. Для сравнения двух независимых групп по одному количественному признаку использовали непараметрический критерий Манна–Уитни. Анализ динамики изученных показателей в процессе лечения осуществляли с помощью критерия Фридмана (в случае более двух зависимых выборок) и парного критерия Вилкоксона (в случае двух зависимых выборок). Проверка статистических гипотез проводилась при критическом уровне значимости 0,01.

Результаты исследования и их обсуждение. Установлено, что при экспериментальной ИКГМ уже на 1 сутки наблюдения изменяется неврологический статус, интегральный показатель по шкале J.H. Garcia снижался в среднем в 3, 4 раза (табл. 1). Угнетение неврологических функций выражалось в развитии различной степени двигательного дефицита на стороне, контрлатеральной очагу по- ражения, гиподинамии, заторможенности животных, статокоординаторных расстройствах. Аналогичные изменения зафиксированы на 3 и 7 сутки экспериментальной ИКГМ. В последующие сроки наблюдения – на 14 и 30 сутки – наблюдалась тенденция к частичному восстановлению неврологической симптоматики. Однако интегральный показатель неврологического статуса по шкале J.H. Garcia статистически значимо отличался от группы ложнооперированных животных во все сроки наблюдения вплоть до 30 суток после индукции ИКГМ. При оценке микроциркуляции в очаге повреждения коры больших полушарий головного мозга выявлено значимое снижение показателя микроциркуляции на 7, 14, 30 сутки после индукции ИКГМ в среднем соответственно на 48, 50, 28 % (табл. 2). При этом не обнаружено значимых отличий показателя микроциркуляции в динамике эксперимента. Изменения неврологического статуса и микроциркуляции нашли отражение в результатах морфологической оценки очага повреждения головного мозга у крыс после ИКГМ (табл. 3). Так, в динамике наблюдения с 7 по 30 сутки эксперимента прогрессивно снижается количество интактных нейронов, увеличивается количество нейронов с хроматолизом, клеток-теней. На этом фоне наблюдается тенденция к увеличению количества мелких кровеносных сосудов в очаге повреждения с 7 до 30 суток после индукции ИКГМ, что является отражением активации неоангиогенеза в комплексе компенсаторных реакций при ишемии головного мозга.

Зафиксированные нарушения неврологического статуса, снижение микроциркуляции, количество интактных нейронов и увеличение количества поврежденных и погибших клеток в очаге повреждения при экспериментальной ИКГМ являются отражением ограничения кровотока, ишемии сенсомоторной зоны коры больших полушарий головного мозга и гипоксического некробиоза нейронов. Известно, что формирование инфаркта происходит в течение 28–72 ч с момента инсульта, а возможно и дольше с учетом влияний сохраняющегося отека мозга и других отдаленных последствий ишемии. Патогенез церебральной ишемии включает угнетение аэробного и анаэробного гликолиза, снижение синтеза АТФ, нарушение активного транспорта ионов через мембрану с раскрытием агонист-зависимых Са2+-каналов и увеличением концентрации свободного цитозольного кальция в нейроне, что приводит к дисфункции эксайтотоксиче-ских медиаторов возбуждения. Особое значение при снижении мозгового кровотока и развитии фокальной ишемии придается глутамат-кальциевому каскаду: индукции (запуск), амплификации (усиление повреждающего потенциала) и экспрессии (конечные реакции каскада, непосредственно приводящие к гибели клетки). На первом этапе в результате выброса большого количества глутамата в синаптическую щель в ответ на ишемию и связывание глутамата с инотропными рецепторами N-метил-D-аспартата, метаболотропными и АМРА-рецепторами открываются кальциевые каналы, возникает массивное вхождение внутрь нейронов ионов Са2+, Са2+-индуцированная эксайтотоксичность. В нейронах снижается содержание калия, увеличивается концентрация натрия, что сопровождается гипергидратацией и отеком, нарушением механизмов синаптической передачи. В результате электролитного дисбаланса изменяются электрические свойства нейронов, развивается аноксическая деполяризация мембран, которая считается главным критерием необратимого поражения клеток.

Применение ЭПО при экспериментальной ИКГМ приводит на 1, 3, 7 сутки наблюдения к частичному восстановлению, а на 14 и 30 сутки – к полному восстановлению неврологического статуса у крыс, оцениваемого по шкале J.H. Garcia (табл. 1). На 14 и 30 сутки эксперимента не обнаружено статистически значимых отличий между группой ложноопе-рированных крыс и крыс с ИКГМ, которым вводили ЭПО. Показатель микроциркуляции в очаге ишемического повреждения коры больших полушарий головного мозга после применения ЭПО увеличивался на 7, 14 и 30 сутки наблюдения по сравнению с группой крыс без применения ЭПО и статистически значимо не отличался от группы ложнооперированных крыс (табл. 2). Нейропротекторный эффект и улучшение кровоснабжения очага ишемии при ИКГМ после применения ЭПО подтверждается данными морфологического исследования мозга. Уже на 7 сутки эксперимента в очаге ишемического повреждения по сравнению с группой животных без введения ЭПО снижается количество нейронов с хроматолизом, клеток-теней, увеличивается количество интактных нейронов и мелких кровеносных сосудов (табл. 3). Аналогичные изменения кле- точного состава и представительства кровеносных сосудов наблюдаются на 14 и 30 сутки наблюдения.

Полагаем, что нейропротекторный эффект ЭПО при экспериментальной ИКГМ обусловлен, прежде всего, прямым влиянием на нейроны и глиоциты, а также активацией неоангиогенеза в очаге ишемического повреждения. Показано, что экспрессия мРНК ЭПО и рецептора ЭПО вдвойне усиливается при гипоксических воздействиях [18]. Внутрикле- точная трансдукция сигнала после связывания ЭПО с EPOR обеспечивается Jak-2-зависи-мыми сигнальными путями: трансдукторы сигналов и активаторы транскрипции (STAT-5, STAT-3), фосфатидилинозитол-3-киназа (PI3K), протеинкиназа В (РКВ), гликоген-синтаза ки-наза-3β (GSK-3β), митоген-активируемая про-теинкиназа (MAPK) и др. [4, 9, 14, 17, 25]. Так, STAT-5 приводит к активации антиапоп-тогенных генов и генов, ответственных за пролиферацию и дифференцировку клеток.

Таблица 1

Table 1

Влияние ЭПО на интегральный показатель неврологического статуса по шкале J.H. Garcia при экспериментальной ИКГМ (Me [Q1–Q3])

Effects of EPO on the integral indicator of the neurological status estimated by Garcia scale at ECI (Me [Q1-Q3])

Группы животных Groups of animals	1 сутки Day 1 (n = 6)	3 сутки Day 3 (n = 6)	7 сутки Day 7 (n = 6)	14 сутки Day 14 (n = 6)	30 сутки Day 30 (n = 6)
1. Ложно-оперированные 1. Sham operated	17 [17,00–18,00]	18 [17,00–18,00]	18 [18,00–18,00]	18 [18,00–18,00]	18 [18,00–18,00]
2. ИКГМ 2. ECI	5 [4,00–5,25]	6 [5,00–7,25]	9 [8,00–10,5]	12 [11,0–13,0]	15 [14,0–16,25]
3. ИКГМ + ЭПО 3. ECI + EPO	6,5 [6,00–7,00]	10 [9,50–11]	13,5 [12–15]	15 [13,75–16,25]	17 [15,75–18,0]
Различия по критерию Фридмана Friedman test differences	P < 0,001	P < 0,001	P < 0,001	P < 0,001	P < 0,001
Различия по критерию Манна–Уитни Mann–Whitney test differences	P 1–2 < 0,001 P 1–3 < 0,001 P 2–3 < 0,001	P 1–2 < 0,001 P 1–3 < 0,001 P 2–3 < 0,001	P 1–2 < 0,001 P 1–3 < 0,001 P 2–3 < 0,001	P 1–2 < 0,001 P 1–3 = 0,05 P 2–3 < 0,001	P 1–2 = 0,003 P 1–3 = 0,06 P 2–3 < 0,001

Таблица 2

Table 2

Влияние ЭПО на показатель микроциркуляции в очаге повреждения при экспериментальной ИКГМ (Me [Q1–Q3])

Effects of EPO on microcirculation in the ischemic focus at ECI (Me [Q1–Q3])

Группа Group	7 сутки Day 7 (n = 6)	14 сутки Day 14 (n = 6)	30 сутки Day 30 (n = 6)
1. Ложно-оперированные 1. Sham operated	5,29 [4,87–6,95]	5,19 [4,57–6,95]	5,21 [4,53–6,95]
2. ИКГМ 2. ECI	2,75 [0,89–3,87]	2,57 [1,36–5,48]	3,77 [2,93–4,38]
3. ИКГМ + ЭПО 3. ECI + EPO	6,34 [4,93–7,60]	5,33 [4,02–7,05]	5,78 [3,38–6,78]
Различия по критерию Крускалла–Уолиса Kruskal–Wallis test differences	P < 0,001	P < 0,001	P < 0,006
Различия по критерию Манна–Уитни Mann–Whitney test differences	P 1–2 = 0,001 P 1–3 = 0,364 P 2–3 = 0,001	P 1–2 = 0,001 P 1–3 = 0,940 P 2–3 = 0,01	P 1–2 = 0,001 P 1–3 = 0,880 P 2–3 = 0,004

Таблица 3

Table 3

Влияние ЭПО на морфометрические показатели в очаге повреждения при экспериментальной ИКГМ (количество клеток / у.е. площади, Me [Q1–Q3])

Effects of EPO on morphometric indicators in the ischemic focus at ECI (cell count / area unit, Me [Q1–Q3])

Показатели Indicators	Группы / Groups
	Группа 2. Ишемия ГМ (ИГМ) Group 2. Cerebral ischemia (CI)			Группа 3. ИГМ+ ЭПО Group 3. CI + EPO
	7 сутки Day 7 (n = 6)	14 сутки Day 14 (n = 6)	30 сутки Day 30 (n = 6)	7 сутки Day 7 (n = 6)	14 сутки Day 14 (n = 6)	30 сутки Day 30 (n = 6)
Неизмененные нейроны Unmodified neurons	36,50 [30,87– 42,77]	30,38 [23,08– 36,39]	25,21 [15,96– 32,29]#	83,4 [79,30– 87,86]*	89,94 [87,64– 91,65]*	91,26 [84,71– 98,25]*
Нейроны с хроматолизом Chromatolytic neurons	25,94 [25,21– 26,73]	34,10 [32,03– 35,09]#	42,10 [40,45– 43,10]#	9,24 [8,96– 10,65]*	7,08 [6,78– 7,73]*	6,10 [5,99– 6,18]*
Клетки-тени Shadow cells	62,25 [58,08– 66,84]	70,75 [67,04– 72,68]#	76,35 [70,77– 78,01]#	10,28 [9,29– 11,65]*	6,76 [6,15– 7,64]*	3,30 [2,71– 3,95]*
Мелкие кровеносные сосуды Small blood vessels	7,13 [6,41– 7,87]	8,84 [7,73– 10,14]	14,26 [11,93– 16,01]	16,27 [15,62– 17,04]*	19,41 [18,52– 20,42]*	25,63 [23,76– 27,60]*

Примечание. * – статистически значимые (р < 0,01) различия с группой 2 на соответствующие сутки, # – с группой 2 на 7 сутки по критерию Крускалла–Уолиса и критерию Манна–Уитни.

Note. * – statistically significant (p < 0.01) differences with group 2 on the respective day, # – with group 2 on day 7 according to Kruskal–Wallis test and Mann–Whitney test.

PI3K, РКВ и MAPK подавляют активность GSK-3β, что приводит к стабилизации мембраны митохондрий (сохранение Δψ митохондриальной мембраны), снижению выхода цитохрома с Apaf-1-зависимой активации каспаз. Кроме того, снижение активности GSK-3β угнетает NFκB-зависимый синтез провоспалительных цитокинов, таких как ИЛ-1β, ИЛ6, ТНФ-α, MCP-1 и др. С другой стороны, РКВ опосредует синтез eNOS в эндотелиальных и др. клетках. В экспериментальных условиях in vitro ЭПО напрямую вызывает деление стволовых клеток головного мозга и их дальнейшую дифференцировку. Кроме этого, ЭПО регулирует созревание и дифференцировку олигодендроглии и пролиферацию астроцитов, оказывает антиапопти-ческий эффект на клетки микроглии [22]. ЭПО препятствует апоптозу нейронов в условиях гистотоксической или циркуляторной гипоксии [11]. При введении ЭПО в желудочки мозга у грызунов ингибировался апоптоз, вызванный ишемией, и предотвращалось развитие неврологической симптоматики. ЭПО, проникая через гематоэнцефалический барьер, напрямую стимулирует функцию нейронов, улучшает их жизнеспособность через активацию кальциевых каналов и высвобождение нейромедиаторов, является антагонистом глутамата, регулирует продукцию нейромедиаторов, увеличивает активность антиоксидантных ферментов, тормозит NO-зависимые свободнорадикальные процессы [19]. ЭПО дозозависимым образом стимулирует неоангиогенез, действуя на рецепторы в церебральных сосудах [26]. Установлено, что в эндоте-лиоцитах в условиях гипоксии комплекс рецептора ЭПО и βCR соединяется с рецептором для VEGF (VEGFR2). Такое взаимодействие необходимо для ЭПО-опосредованной продукции NO эндотелиоцитами [20, 21].

Выводы

• 1.    При экспериментальной ишемии сенсомоторной зоны коры головного мозга, индуцированной диатермокоагуляцией пиаль-ных сосудов у крыс на 1–3–7–14–30 сутки наблюдения снижается интегральный показатель неврологического статуса, оцениваемый по шкале J.H. Garcia, на 7–14–30 сутки снижается показатель микроциркуляции, снижается

• 2.    Применение при экспериментальной ишемии коры головного мозга эритропоэтина в суммарной дозе 15000 МЕ/кг приводит на 3–7 сутки наблюдения к частичному, а на 14–30 сутки – к полному восстановлению неврологического статуса у животных, восстановлению на 7–14–30 сутки микроциркуляции, увеличению количества интактных нейронов, мелких кровеносных сосудов, уменьшению представительства нейронов с хроматолизом и клеток-теней в очаге ишемии.

количество интактных нейронов, увеличивается количество нейронов с хроматолизом и клеток-теней в очаге повреждения головного мозга.