Нейропротекторный эффект эритропоэтина при экспериментальной ишемии спинного мозга

Спинальный инсульт – это нарушение спинального кровообращения с повреждением спинного мозга и расстройством его функций вследствие затруднения или прекращения поступления крови. Сосудистые заболевания спинного мозга имеют частоту около 1 % от всех нарушений мозгового кровоснабжения, а соотношение частоты возникновения инсультов головного и спинного мозга 1:4. Инвалидизация при спинальном инсульте составляет до 30 % от всех случаев заболевания [4, 16]. В основе развития острой ишемии спинного мозга лежит редукция мозгового кровотока, а степень повреждающего действия ишемии определяется, прежде всего, тяжестью и длительностью снижения кровоснабжения нервной ткани. Как известно, в течение нескольких часов после снижения кровотока центральная зона инфаркта окружена ишемизированной, но живой тканью – это зона пенумбры [18, 25, 29, 38, 42]. Рядом авторов показано, что развитие некроза в зоне пенумбры можно избежать с помощью реперфузии и применения нейропротекторных препаратов [1, 5, 22, 28, 30].

В последние годы большой интерес у спе- циалистов различного профиля вызывают мультитропные негемопоэтические эффекты эритропоэтина (ЭПО). Результаты многочисленных клинических и экспериментальных исследований свидетельствуют об эффектах ЭПО на функциональное состояние сердечнососудистой системы, нервной системы, аффективный статус, систему гемостаза, иммунный статус, репродуктивную систему и почки [3, 10, 12–14, 23, 24]. Ранее нами установлено позитивное влияние ЭПО на аффективный статус, психофизиологический статус, функциональное состояние вегетативной нервной системы у больных хронической почечной недостаточностью, реализуемое за счет анти-анемического и дезинтоксикационного действия ЭПО [7–13]. Показано, что плейотропные эффекты ЭПО реализуются за счет наличия к нему специфических рецепторов на различных клетках, в том числе на нейронах [25]. Установлены нейропротекторные свойства эритропоэтина, связанные с блокадой апоптоза, антигипоксическим действием [19–21, 27, 31–34]. С учетом вышеизложенного, оценка эффективности применения ЭПО при ишемических повреждениях спинного мозга представляется перспективной и актуальной задачей для практической неврологии и клинической патофизиологии. Цель работы – исследовать влияние ЭПО на показатели этологического статуса и морфологические изменения в нейронах при экспериментальной ишемии спинного мозга.

Материалы и методы исследования. Для реализации поставленной цели проведён эксперимент на 54 нелинейных половозрелых крысах разного пола массой 220–250 г. Животные находились в стандартных условиях вивария на типовом рационе в соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (ETSIN 123, 18 марта 1986 г.), включая приложение А от 15.06.2006, с Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и совета Европейского союза по охране животных, используемых в научных целях от 22.09.2010 г. Оперативные вмешательства проводились в экспериментальной операционной с соблюдением правил асептики и антисептики под внутримышечным обезболиванием препаратом «Золетил-100» (Virbac «Sante Animale», Фpaнция) в дозе 2 мг/кг массы.

Все животные были случайным образом разделены на три группы. Группа 1 (n = 6) представлена интактными животными (контроль). Группа 2 (n = 24) – животные с ишемией спинного мозга. Ишемию спинного мозга моделировали путем тотальной интрава-зальной окклюзии брюшной аорты и ее ветвей по методике, предложенной Г.З. Суфиановой и соавт. [6]. Группа 3 (n = 24) – животные, которым на фоне ишемии спинного мозга внутрибрюшинно вводили рекомбинантный человеческий эритропоэтин («Эпокрин» (эпоэтин альфа), ФГУП «Гос. НИИ ОЧБ» ФМБА России, Санкт-Петербург) в дозе 5000 МЕ/кг массы тела животного через 3 часа, 24 часа и 48 часов от индукции ишемии спинного мозга, суммарная доза введенного ЭПО составила 15000 МЕ/кг. Второй группе животных вводили эквиобъемное количество физиологического раствора. Схема введения ЭПО выбрана, исходя из метода лечения ишемии спинного мозга предложенного М. Голд [14]. Выведение животных из эксперимента осуществлялось путём внутрисердечного введения 3 мл 7,5%-ного раствора хлористого калия (ООО «Фармлэнд» Республика Беларусь).

Этологические и морфологические исследования во второй и третьей группах животных проводили на 3, 7, 14 и 30 сутки после индукции ишемии спинного мозга. Этологический статус животных исследовали по 6-бальной шкале с расчетом интегрального показателя поведенческих реакций (ИППР), который включал оценку двигательной активности передних и задних конечностей, реакции конечностей и хвоста на температурный раздражитель, сохранения рефлекса позы, имитации восстановления функции обеих конечностей [15]. После выведения животных из эксперимента извлекался спинной мозг, производилась его макроскопическая оценка, фрагменты окрашивались гематоксилином и эозином для обзорной микроскопии, по методу Бильшовского – для выявления миелиновых волокон, по методу Ниссля – для верификации тигроидного вещества Ниссля, глиальных клеток. Микропрепараты исследовали на микроскопе «Leica DMRXA» (Германия). Морфометрическими методами с помощью компьютерной программы анализа цветового изображения «ДиаМорф Cito-W» (Россия) при увеличении микроскопа ×400 в 10 случайно отобранных полях зрения на условной единице площади оценивали: количество неизменённых (нормальных) нейронов; количество нейронов с хроматолизом; количество клеток-теней; количество глиоцитов; количество мелких кровеносных сосудов (капилляров, артериол). Полученные результаты обрабатывали с помощью лицензионного пакета прикладных программ Statistica 6.0 (Stat Soft Inс., USA). Статистическая значимость различий сравниваемых признаков в группах проводилась с помощью непараметрического критерия Манна–Уитни. Различия считали значимыми при р < 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение. У всех животных в постишемическом периоде отмечалась симметричная параплегия по периферическому типу, выявляемая сразу после выхода животных из наркоза. Регистрировалось исчезновение температурной чувствительности с задних конечностей и поясничной области. В динамике отмечалось развитие тазовых нарушений в виде недержания мочи и кала. Такая картина наблюдалась вплоть до 30 суток опыта. Динамика изменений ИППР при ишемии спинного мозга по сравнению с группой контроля представлена в табл. 1. Результаты исследования показали, что ИППР у крыс был значительно ниже на 3, 7, 14, 30 сутки эксперимента по сравнению с аналогичным показателем контрольной группы. В динамике наблюдений к 30 суткам после индукции ишемии спинного мозга определялось медленное восстановление поведенческих реакций. Так, на 30 сутки эксперимента ИППР статистически значимо превышал значение ИППР на 3 сутки, но не достигал значений в группе интактных животных.

Результаты морфометрической оценки гистологических препаратов поясничного утолщения спинного мозга при экспериментальной ишемии представлены в табл. 2. На 3 сутки ишемии спинного мозга отмечались выраженные изменения в передних рогах – хрома- толиз цитоплазмы, пикноз ядер, растворение глыбок базофильного вещества Ниссля в нейронах с превращением их в клетки-тени. Встречались также неизмененные и гипер-хромные нейроны. Отмечалась нейронофагия, перицеллюлярный и периваскулярный отек в белом веществе. К 7 суткам в центральной зоне ишемического очага нарастали деструктивные изменения в нейронах. Количество нормальных нейронов к 7 суткам было снижено по сравнению с 3 сутками эксперимента, а количество нейронов с хроматолизом, клеток-теней, количество глиальных клеток увеличивалось. Представительство капилляров и артериол было низким, но статистически значимо возрастало по сравнению с 3 сутками эксперимента. Морфологические изменения в тканях спинного мозга на 14 сутки эксперимента были сходными с таковыми на 7 сутки. Отмечалась тенденция к росту количества нормальных нейронов, значимо увеличивалось количество капилляров и артериол относительно 3 и 7 суток наблюдения, однако представительство нейронов с хроматолизом, клеток-теней, количество глиальных клеток возрастало по сравнению с 3 и 7 сутками эксперимента. На 30 сутки ишемии спинного мозга увеличивалось количество интактных нейронов по сравнению с 7 сутками эксперимента. Количество глиальных клеток снижалось по сравнению с 14 сутками, но было больше, чем на 3 сутки ишемии спинного мозга. Представительство нейронов с хроматолизом, капилляров и артериол увеличивалось по сравнению с 3, 7 и 14 сутками, а количество клеток-теней возрастало по сравнению с 3 и 7 сутками.

В условиях экспериментального моделирования ишемии спинного мозга окклюзия брюшной аорты ниже почечных артерий приводит к редукции кровотока в сегментарных артериях

Таблица 1

Table 1

Интегральный показатель поведенческих реакций при экспериментальной ишемии спинного мозга (М ± m, баллы)

Integral indicator of behavioral responses at experimental spinal cord ischemia (М ± m, points)

Группа 1. Интактный контроль Group 1. Intact control	Группа 2. Ишемия СМ Group 2. Spinal cord ischemia
	3 сутки Day 3	7 сутки Day 7	14 сутки Day 14	30 сутки Day 30
5,9 ± 0,3	0,9 ± 0,4*	1,5 ± 0,6*	2,6 ± 0,7*	2,9 ± 0,5*, **

Примечание. * – p < 0,05 при сравнении с группой 1; ** – при сравнении с 3 сутками в группе 2.

Note . * – p < 0.05 in comparison with the group 1; ** – in comparison with day 3 in the group 2.

Таблица 2

Table 2

Морфометрические показатели при экспериментальной ишемии спинного мозга (М ± m, количество / у. е. площади)

Morphometric indicators at experimental spinal cord ischemia (М ± m, number / unit area)

Показатель Indicator	Группа 2. Ишемия СМ Group 2. Spinal cord ischemia
	3 сутки Day 3	7 сутки Day 7	14 сутки Day 14	30 сутки Day 30
Количество нормальных нейронов Number of normal neurons	30,2 ± 2,1	24,3 ± 1,1*	27,8 ± 1,3	29,9 ± 2,5**
Число нейронов с хроматолизом Number of chromatolytic neurons	29,3 ± 0,6	36,4 ± 0,9*	43,6 ± 2,1*, **	53,8 ± 1,2*, **, #
Число клеток-теней Number of ghost cells	36,2 ± 2,3	58,1 ± 2,5*	63,8 ± 2,8*, **	67,9 ± 2,2*, **
Количество глиальных клеток Number of glial cells	92,3 ± 1,9	115,5 ± 2,1*	123,4 ± 2,2*, **	112,2 ± 1,9*, #
Количество кровеносных сосудов Number of blood vessels	4,3 ± 0,2	6,2 ± 0,4*	8,1 ± 0,7*, **	10,2 ± 0,6*, **, #

Примечание. * – p < 0,05 при сравнении с 3 сутками; ** – с 7 сутками; # – с 14 сутками эксперимента.

Note. * – p < 0.05 in comparison with day 3; ** – with day 7; # – with day 14 of the experiment.

спинного мозга. Известно, что снижение объемного кровотока ниже 20 мл/100 г ткани/мин является критическим для функционирования спинальных нейронов [25, 26, 28, 32, 40]. При этом уровне кровотока отмечается дестабилизация клеточных мембран, дисфункция мембранных каналов активного ионного транспорта, избыточное высвобождение возбуждающих нейротрансмиттеров. Запускаются этапы глутамат-кальциевого каскада, в результате которого происходят необратимые изменения в нейронах, приводящие к их повреждению и гибели. Морфологическим эквивалентом описанных изменений является развитие инфаркта спинного мозга. Это подтверждается полученными нами морфологическими данными: появлением нейронов с хроматолизом, клеток теней, увеличением количества глиальных клеток, снижением количества мелких кровеносных сосудов. Это свидетельствовало о том, что на фоне отсутствия какой-либо терапии происходило расширение зоны инфарктного ядра и сужение зоны ишемической полутени – пенумбры. По всей видимости, структурно неизмененные, но с признаками дисфункции нейроны в зоне пенумбры подвергаются апоптозу. Это подтверждается другими исследованиями, когда при фокальной ишемии мозга большинство апоптозных клеток определялись вдоль внутренней границы ишемического ядра, что, воз- можно, отражает роль апоптоза клеток в расширении зоны инфаркта [17–19, 24, 26, 27, 29]. Кроме этого, в препаратах спинного мозга нами отмечено более чем двукратное увеличение капиллярной сети к 30 суткам эксперимента. Полагаем, что пролиферация клеток сосудов, формирование нового сосудистого русла связаны с усилением синтеза факторов роста в условиях циркуляторной гипоксии, в том числе фактора роста сосуистого эндотелия (VEGF) [2].

Из-за значительных повреждений нейронов в зоне инфаркта ограничивается либо полностью блокируется передача нервного импульса, что проявляется изменением этологического статуса животных: развитием нижней параплегии, тазовыми и чувствительными расстройствами ниже уровня ишемии спинного мозга. Частичное восстановление этологического статуса животных к 30 суткам эксперимента может быть обусловлено восстановлением нейронов после улучшения их кровоснабжения в зоне ишемического повреждения.

На следующем этапе работы оценивали влияние парентерального введения ЭПО на этологический статус и морфологические показатели спинного мозга при экспериментальной спинальной ишемии. После трехкратного введения ЭПО в течение 48 часов от индукции ишемии спинного мозга нами за-

Таблица 3

Table 3

Влияние ЭПО на интегральный показатель поведенческих реакций у крыс (М ± m, баллы) EPO effects on the integral indicator of behavioral responses in rats (М ± m, points)

Группа 1. Интактный контроль Group 1. Intact control	Группа 2. Ишемия СМ Group 2. Spinal cord ischemia				Группа 3. Ишемия СМ +ЭПО Group 3. Spinal cord ischemia + EPO
	3 сутки Day 3	7 сутки Day 7	14 сутки Day 14	30 сутки Day 30	3 сутки Day 3	7 сутки Day 7	14 сутки Day 14	30 сутки Day 30
o' -н urf	-н о"	ХО' о" -Н	-н О С^Г	Csf	4ГГ	4ГГ	4ГГ	ОО 4ГГ

Примечание * – p < 0,05 при сравнении с группой 1; # – при сравнении с группой 2.

Note. * – p < 0.05 in comparison with group 1; # – in comparison with group 2.

фиксированы изменения поведенческой активности животных, представленные в табл. 3. У животных с ишемией спинного мозга в условиях применения ЭПО на 3, 7, 14 и 30 сутки наблюдения отмечалось более раннее по сравнению с группой животных с ишемией спинного мозга восстановление интегрального показателя поведенческих реакций. Статистически значимые отличия с группой интактных животных зафиксированы только на 3 сутки наблюдения. Все животные, начиная с 3 суток после индукции ишемии спинного мозга, активно передвигались по клетке, обращались к пище и воде.

При исследовании гистологических препаратов спинного мозга на 3 и 7 сутки ишемии спинного мозга в условиях применения ЭПО отмечалась хорошая сохранность нейронов, среди которых встречались отдельные гиперхромные клетки и лишь единичные нейроны имели признаки набухания и сморщивания. На более поздних сроках наблюдения (14 и 30 сутки ишемии спинного мозга) в гистологической картине отмечалось отсутствие глиосоединительных рубцов, что свидетельствовало о слабо выраженных ишемических повреждениях, без формирования зоны некроза в тканях спинного мозга. Клеточные элементы спинного мозга выглядели сохранными, а со стороны микроциркуляторного русла отмечалась выраженная пролиферативная реакция. Все эти изменения в гистологической картине нашли отражение и при морфометрическом исследовании препаратов, результаты которого представлены в табл. 4.

Установлено, что в условиях применения

ЭПО, при экспериментальной ишемии спинного мозга, на 3 сутки количество нормальных нейронов в спинном мозге было выше более чем в два раза по сравнению с группой животных с ишемией спинного мозга, количество нейронов с хроматолизом, а также клеток-теней статистически значимо снижалось, а количество глиальных клеток и кровеносных сосудов – увеличивалось. На 7 сутки наблюдения представительство интактных нейронов, глиоцитов, кровеносных сосудов возрастало, а число нейронов с хроматолизом, клеток-теней снижалось при сравнении с группой животных с ишемией спинного мозга, а также относительно 3 суток наблюдения. Морфометрическая картина на 14 сутки ишемии спинного мозга характеризовалась увеличением количества нормальных нейронов и глиальных клеток, снижением представительства нейронов с хроматолизом по сравнению с группой животных с ишемией спинного мозга, а также при сравнении с показателями на 3 сутки наблюдения; количество клеток-теней снижалось, а содержание мелких кровеносных сосудов увеличивалось по сравнению с группой животных с ишемией спинного мозга, а также при сравнении с показателями на 3 сутки и 7 сутки наблюдения.

На 30 сутки ишемии спинного мозга эффект ЭПО проявился в увеличении количества интактных нейронов, мелких кровеносных сосудов при сравнении со второй группой животных, а также относительно 3 и 7 суток наблюдения, представительство нейронов с хроматолизом, клеток-теней снижалось при сравнении со второй группой животных, 3, 7

Таблица 4

Table 4

Влияние ЭПО на морфометрические показатели при экспериментальной ишемии спинного мозга (М ± m, количество / у. е. площади)

EPO effects on morphometric indicators at experimental spinal cord ischemia(М ± m, number / unit area)

Показатель Indicator	Группа 2. Ишемия СМ Group 2. Spinal cord ischemia				Группа 3. Ишемия СМ + ЭПО Group 3. Spinal cord ischemia + EPO
	3 сутки Day 3	7 сутки Day 7	14 сутки Day 14	30 сутки Day 30	3 сутки Day 3	7 сутки Day 7	14 сутки Day 14	30 сутки Day 30
Количество нормальных нейронов Number of normal neurons	30,2 ± 2,1	24,3 ± 1,1	27,8 ± 1,3	29,9 ± 2,5	69,3 ± 3,1 #	81,1 ± 2,8 *,#	87,7 ± 2,5 ***#	90,8 ± 3,5 ***#
Число нейронов с хроматолизом Number of chromatolytic neurons	29,3 ± 0,6	36,4 ± 0,9	43,6 ± 2,1	53,8 ± 1,2	25,2 ± 0,4 #	20,1 ± 0,8 *,#	17,1 ± 0,5 *,#	12,2 ± 0,3 * *****#
Число клеток-теней Number of ghost cells	36,2 ± 2,3	58,1 ± 2,5	63,8 ± 2,8	67,9 ± 2,2	15,2 ± 0,3 #	10,1 ± 0,2 *,#	8,3 ± 0,4 ***#	3,8 ± 0,5 * *****#
Количество глиальных клеток Number of glial cells	92,3 ± 1,9	115,5 ± 2,1	123,4 ± 2,2	112,2 ± 1,9	124,7 ± 2,2 #	135,8 ± 3,2 *,#	143,9 ± 3,1 ***#	156,8 ± 3,4 ******#
Количество кровеносных сосудов Number of blood vessels	4,3 ± 0,2	6,2 ± 0,4	8,1 ± 0,7	10,2 ± 0,6	7,9 ± 0,1 #	11,9 ± 0,2 *,#	16,8 ± 0,5 ***#	17,3 ± 0,3 ***#

Примечание. # – p < 0,05 при сравнении с группой 2; * – с 3 сутками в группе 3; ** – с 7 сутками в группе 3; *** – с 14 сутками в группе 3.

Note. # – p < 0.05 in comparison with group 2; * – with day 3 in the group 3; ** – with day 7 in the group 3;

*** – with day 14 in the group 3.

и 14 сутками наблюдения, а количество глиальных клеток статистически значимо увеличивалось при сравнении со второй группой животных, а также относительно 3, 7, 14 суток наблюдения. Итак, в условиях применения ЭПО при ишемии спинного мозга к 30 суткам наблюдения количество нормальных нейронов в среднем в 3 раза превосходило аналогичный показатель у животных при ишемии спинного мозга, количество клеток-теней уменьшилось в среднем в 16 раз, количество нейронов с хроматолизом уменьшилось в среднем в 4 раза, а количество мелких кровеносных сосудов увеличилось в среднем на 70 %.

Зафиксированное нами в экспериментальных условиях in vivo повышение под влияни- ем ЭПО резистентности нейронов спинного мозга к ишемическому повреждению может быть обусловлено несколькими механизмами [19, 22, 33, 35–37, 39, 41, 43, 44]. Во-первых, показано, что ЭПО способен проникать через гематоэнцефалический барьер, взаимодействовать со специфическими рецепторами на поверхности нейронов и глиальных клеток, улучшать жизнеспособность поврежденных нейронов через активацию кальциевых каналов, синтез и высвобождение нейромедиаторов, антагонистические взаимосвязи с глутаматом. Во-вторых, ЭПО увеличивает в нейронах активность антиоксидантных ферментов, тормозит NO-зависимые свободнорадикальные процессы. В-третьих, через взаимодействие с рецепторами на эндотелиоцитах цереб- ральных капилляров ЭПО стимулирует их митоз и активирует неоангиогенез. В-четвертых, ЭПО способен стимулировать созревание и дифференцировку олигодендроглии и пролиферацию астроцитов, а также оказывать анти-апоптический эффект на клетки микроглии. Показано, что высвобождение ЭПО из астроцитов является одним из механизмов, защищающих мозг от апоптоза, индуцированного гипоксией.

Выводы

• 1.    При экспериментальной ишемии спинного мозга, индуцированной тотальной ин-травазальной окклюзией брюшной аорты и ее ветвей, наблюдается прогрессирующее от 3 к 14 суткам и частично восстанавливающееся к 30 суткам изменение этологического статуса животных в виде симметричной параплегии по периферическому типу, исчезновение тактильной чувствительности задних конечностей и поясничной области, недержания мочи и кала. Морфологические изменения поясничного отдела при спинальной ишемии включают прогрессирующее от 3 к 30 суткам увеличение количества нейронов с хроматолизом, клеток-теней, глиальных клеток, мелких кровеносных сосудов, количество интактных нейронов максимально снижается на 3 и 7 сутки и начинает восстанавливаться на 30 сутки.

• 2.    Применение ЭПО в суммарной дозе 15000 МЕ/кг при экспериментальной ишемии спинного мозга приводит к частичному на 3 сутки и полному на 7–14–30 сутки наблюдения восстановлению поведенческой активности животных. В условиях применения ЭПО в спинном мозге наблюдается прогрессирующее от 3 к 30 суткам наблюдения увеличение количества нормальных нейронов, глиальных клеток, мелких кровеносных сосудов, снижение представительства нейронов с хроматолизом, клеток-теней.