Некоторые аспекты введения в культуру in vitro сортов смородины чёрной селекции ВНИИСПК

Bве^ение. B настоящее время метод клонального размно^ения растений in vitro широко используется в системе ускоренного производства оздоровленного посадочного материала плодовых и ягодных культур. Для получения безвирусного материала часто применяется одна из моделей клонального микроразмно^ения – индукция развития меристем из почек [1]. Она включает в себя несколько этапов: выбор растения-донора, изолирование эксплантов (введение в культуру in vitro ), получение хорошо растущей стерильной культуры; собственно микроразмно^ение и получение максимального количества мериклонов; укоренение размно^енных побегов in vitro и адаптация пробирочных растений к почвенным условиям [2].

Mноголетние исследования показали, что реализация регенерационного потенциала растительных организмов на всех этапах культивирования зависит от влияния генетических, физиологических, химических и физических факторов культивирования [2-8].

Целью иссле^ований являлось изучение развития эксплантов сортов чёрной смородины селекции ФГБНУ BНИИСПК на начальном этапе клонального микроразмно^ения в зависимости от типа стерилизующего вещества, происхо^дения эксплантов, генотипических особенностей сортов и срока введения в культуру.

Услови^, материалы и мето^ы. Объекты исследований : перспективные сорта смородины чёрной среднего срока созревания селекции BНИИСПК: ^^урная, Орловская серенада, Очарование, Чудное мгновение.

Исследования проводились согласно общепринятым методикам [9, 10].

Bведение в культуру in vitro осуществлялось в весенний (март), летний (июнь) и осенний (начало сентября) сроки введения.

Исходным материалом в весенний и осенний период слу^или изолированные почки с однолетних одревесневших побегов. B весенний период побеги помещали в сосуд с водой и выдер^ивали при комнатной температуре до состояния зелёного конуса. B осенний период исходным материалом являлись закрытые верхушечные почки. B летний период введения источниками эксплантов слу^или верхушечные почки с растущих зелёных побегов.

Стерилизацию растительного материала проводили по схеме: промывка побегов ^ подготовка почек ^промывание под проточной водой (40-60 мин) ^ обработка 70%-ным раствором этанола (10 с) ^ промывание стерильным дистиллятом (10 мин) => обработка основным стерилизующим агентом (5 или 10 мин) ^ 3-кратное промывание стерильным дистиллятом (по 10 мин).

Используемые стерилизаторы:

̶ мертиолат (C 9 H 9 HgNaO 2 S) в концентрации 0,1%, экспозиция 10 мин;

̶ ртуть двухлористая (сулема) HgCl 2 в концентрации 0,1%, экспозиция 10 мин.

После стерилизации экспланты помещались в раствор аскорбиновой кислоты (3 г/л) с целью сни^ения эффекта «фенольного облака».

После вычленения экспланты выса^ивались на среду Mурасиге-Скуга с добавлением 6-Б^П в концентрации 0,5 мг/л, аскорбиновой кислоты 10 мг/л, тройного количества хелата ^елеза. pH среды 6,0.

Культивирование эксплантов проводилось при освещённости 2000-2500 лк, температуре 23°С, фотопериоде 16/8 ч.

Результаты и обсуждение. B проводимых экспериментах отмечено, что на эффективность инициации культуры in vitro оказывают влияние сортовые особенности, сроки введения в культуру, происхо^дение эксплантов и стерилизующие вещества.

При использовании 0,1% раствора сулемы в весенний период наибольший выход неинфицированных эксплантов показали сорта ^^урная, Орловская серенада и Очарование.

При стерилизации 0,1% раствором мертиолата в весенний период количество ^изнеспособных эксплантов составило по исследуемым сортам 20-58%, доля инфицированных растений была относительно высокой – 10-17%.

B обоих вариантах стерилизации в весенний период некроз отмечался у 18-69% эксплантов, что связано, видимо, с особенностями физиологии и морфологии почек в данный период вегетации.

B летний период стерилизация 0,1% раствором сулемы оказалась эффективна для всех сортов, при^иваемость составила 66-83%. Наиболее эффективным летний период оказался для сортов ^^урная (83,4%), Очарование (81,8%), наименее – для сорта Чудное мгновение (66,0%). Контаминация была выше, чем в весенний период и составила от 2% у сорта Очарование до 5% у сортов Орловская серенада и Чудное мгновение.

B летний период эффективность от использования 0,1% раствора мертиолата оказалась несколько ни^е: наибольшее количество ^изнеспособных эксплантов отмечено у сорта Чудное мгновение (86%), минимальное – у сорта Орловская серенада (45%). Инфицированность растений была ни^е, чем в весенний период у сортов ^^урная и Очарование. У сорта Орловская серенада доля зара^ённых эксплантов оказалась самой высокой (32%).

Большое число погибших эксплантов в обоих вариантах (4-29%) объясняется открытостью меристем и ^ёстким воздействием стерилизующих агентов на растительные ткани.

B осенний период стерилизация 0,1% раствором сулемы оказалась наиболее эффективной для сорта Орловская серенада (88%), наименее – для сорта Чудное мгновение (40%). Наименьшая контаминация отмечалась у сорта ^^урная (3,5%), в то время как у остальных сортов колебалась в пределах 4-8%. Доля погибших эксплантов оказалась высокой у сортов ^^урная, Очарование и Чудное мгновение (23-52%).

Эффективность стерилизации 0,1% раствором мертиолата в осенний период достигла 96%, наименьшее количество ^изнеспособных эксплантов отмечалось у сорта Очарование (71%). Доля зара^енных эксплантов составила 2-9%, погибших эксплантов – 2-24% (табл. 1).

Таблица 1 – Результативность введения в культуру эксплантов при применении различных стерилизующих веществ в зависимости от периода введения и сортовых особенностей, 2018-2019 гг.

Сорт	Показатели ^изнеспособности	0,1% сулема			0,1% мертиолат
		весна	лето	осень	весна	лето	осень
^^урная	Некроз, %	18,0	12,7	23,1	36,0	17,0	10,9
	Контаминация, %	4,0	3,9	3,5	17,0	3,1	5,6
	Доля ^изнеспособных эксплантов, %	78,0	83,4	73,4	47,0	79,9	83,5
Орловская серенада	Некроз, %	21,0	16,1	7,7	26,0	22,6	2,5
	Контаминация, %	3,0	5,1	4,3	16,0	32,0	2,0
	Доля ^изнеспособных эксплантов, %	77,0	78,8	88,0	58,0	45,4	95,5
Очарование	Некроз, %	28,0	16,2	34,4	50,0	14,5	24,3
	Контаминация, %	1,0	2,0	4,9	10,0	6,3	4,7
	Доля ^изнеспособных эксплантов, %	71,0	81,8	60,7	40,0	79,2	71,0
Чудное мгновение	Некроз, %	53,0	29,0	52,1	69,0	4,0	8,6
	Контаминация, %	2,0	5,0	7,6	11,0	10,5	2,9
	Доля ^изнеспособных эксплантов, %	45,0	66,0	40,3	20,0	85,5	88,5

Исследования особенностей развития эксплантов различного происхо^дения проводились в весенний период. Отмечалось, что пазушные и верхушечные почки сходны ме^ду собой морфологически. Почки имели мелкие меристемы, располагающиеся по периферии. Большую часть почки занимали зачаточные цветки. Для предотвращения травмирования меристем бутоны не удалялись. По мнению Д.Н. Сковородникова и Ф.Ф. Сазонова (2011), сохранение цветоносов не влияло на развитие регенеранта. Однако, в наших исследованиях, сохранение фрагментов зачаточных соцветий вызывало их разрастание, деформацию и некроз. Развитие таких эксплантов происходило неравномерно: часть меристем погибала, часть сохраняла регенерационные способности.

Наличие в почках более одной меристемы обусловило формирование у части эксплантов нескольких регенерантов одновременно.

Показатели ^изнеспособности эксплантов при применении различных стерилизующих веществ в зависимости от происхо^дения экспланта представлены в таблице 2. При^иваемость эксплантов, полученных как из боковых, так и из верхушечных почек, высокая у сортов ^^урная, Орловская серенада и Очарование. При этом при стерилизации раствором 0,1% сулемы количество ^изнеспособных эксплантов выше, чем при стерилизации 0,1% раствором мертиолата. B варианте с использованием раствора мертиолата отмечается различие ме^ду при^иваемостью эксплантов из верхушечных и боковых почек: при^иваемость первых выше (56-66%), чем вторых (28-52%). При стерилизации 0,1% раствором сулемы различия показателей при^иваемости ме^ду типами эксплантов менее выра^ены. Исключение составляет сорт Чудное мгновение, для которого при^иваемость при стерилизации 0,1% раствором мертиолата в обоих вариантах составляет 20%, а при обработке 0,1% раствором сулемы количество ^изнеспособных эксплантов из пазушных почек больше в 2,1 раза.

Таблица 2 – Результативность введения в культуру эксплантов при применении различных стерилизующих веществ в зависимости от происхо^дения экспланта и сортовых особенностей в весенний период, 2019 г.

Сорт	Показатели ^изнеспособности	0,1% сулема		0,1% мертиолат
		Л -0 т 5 5 £ ф 5 Ш ф	у 5 Л ф CD Н о о о о. Ш Ф	Л -0 т 5 5 £ ф 5 Ш ф	CD Н о о о о. Ш Ф
^^урная	Некроз, %	26,7	12,0	40,0	34,0
	Контаминация, %	0,0	6,0	4,0	24,0
	Доля ^изнеспособных эксплантов, %	73,3	82,0	56,0	42,0
Орловская серенада	Некроз, %	19,0	22,0	27,0	26,0
	Контаминация, %	0,0	4,0	7,0	22,0
	Доля ^изнеспособных эксплантов, %	81,0	74,0	66,0	52,0
Очарование	Некроз, %	32,0	26,0	37,0	58,0
	Контаминация, %	4,0	0,0	3,0	14,0
	Доля ^изнеспособных эксплантов, %	64,0	74,0	60,0	28,0
Чудное мгновение	Некроз, %	71,0	43,0	73,0	66,0
	Контаминация, %	3,0	2,0	7,0	14,0
	Доля ^изнеспособных эксплантов, %	26,0	55,0	20,0	20,0

Bо всех вариантах опыта высокая доля погибших эксплантов отмечается у сорта Чудное мгновение: 43-71% и 66-73%.

Доля инфицированных эксплантов в вариантах с использованием 0,1% раствора сулемы и 0,1% раствора мертиолата при введении меристем из верхушечных почек не превысила 7%. Наибольшая контаминация отмечалась на боковых меристемах в варианте с применением 0,1% раствора мертиолата (14-24%).

Bыво^ы. Из исследуемых факторов культивирования при введении в культуру смородины чёрной наиболее существенное влияние оказывают генотипические особенности и сроки изоляции.

Применение стерилизующих агентов не имело решающего влияния на эффективность введения в культуру.

B зависимости от срока изоляции в качестве источника эксплантов рекомендуется использовать в летний период верхушечные почки с растущих зелёных побегов, в весенний и осенний периоды – меристемы из почек с удалёнными бутонами.

B весенний период источником меристем могут быть боковые почки с однолетних одревесневших побегов.

БͶБЛͶОГРАФͶЯ

• 1.    Bысоцкий B.^. Биотехнологические методы в современном садоводстве // Плодоводство и ягодоводство России. 2011. Т. 26. С. 3-10.

• 2.    Клональное размно^ение растений чёрной смородины (Ribes nigrum L.) in vitro / Г.К. Оразбаева [и др.] // Bестник науки Каз^ТУ им. С. Сейфуллина. 2012. № 1(72). С. 115-124.

• 3.    Ишмуратова M.M. Размно^ение сортов смородины чёрной (Ribes nigrum L.) башкирской селекции в культуре in vitro // Bестник Удмуртского университета. Серия «Биология. Науки о Земле». 2017. Т.27. Bып. 4. С. 455-461.

• 4.    Колбанова E.B. Клональное микроразмно^ение смородины черной сорта Санюта // Плодоводство и ягодоводство России. 2011. Т. 26. С. 222-229.

• 5.    Bлияние минерального состава питательной среды на морфогенез садовых растений in vitro / О.B. Mатушкина [и др.] // Дости^ения науки и техники ^ПК. 2014. № 1. С. 41-42.

• 6.    Mацнева О.B. Эффективность применения стерилизующих агентов для эксплантов земляники // Селекция и сорторазведение садовых культур. 2018. Т. 5. № 1. С. 71-73.

• 7.    Семенас С.Э. Mетодика клонального микроразмно^ения сортов земляники // Плодоводство: сборник научных трудов Белорусского НИИП. 2000. Т. XXII. С. 138-145.

• 8.    Сельскохозяйственная биотехнология / B.С. Шевелуха [и др.]. M.: Bысшая школа. 1998. 416 с.

• 9.    Mетодические рекомендации по использованию биотехнологических методов в работе с плодовыми, ягодными и декоративными культурами / E.Н. Д^игадло, M.И. Д^игадло, Л.B. Голышкина; [под ред. E.Н. Д^игадло]. Орел: Изд-во BНИИСПК. 2005. 49 с.

• 10.    Размно^ение плодовых и ягодных растений в культуре in vitro / Н.B. Кухарчик, M.С. Кастрицкая, С.Э. Семенас [и др.]; [под общ. ред. Н.B. Кухарчик]. Mинск: Беларуская навука. 2016. 208 с.

• 11.    Сковородников Д.Н. Особенности клонального микроразмно^ения смородины черной // Плодоводство и ягодоводство России. 2011. Т. 26. С. 396-400.

• 12.    Шахов B.B. Сравнительная характеристика сроков введения эксплантов чёрной смородины (Ribes nigrum L.) в культуру in vitro // Современное садоводство – Contemporary horticulture. 2017. № 4. С. 102-105.