Некоторые гематологические параметры бычка-кругляка (Neogobius melanostomus Pallas, 1814) Саратовского водохранилища

Бычок-кругляк ( Neogobius melanostomus Pallas, 1814) является видом, вселившимся в Саратовское водохранилище после его образования. Он был обнаружен на Средней Волге в 1968 г. в Куйбышевском водохранилище [3], а затем – в Саратовском [4]. Данный вид в настоящее время является массовым в прибрежной зоне водоема вследствие своей широкой экологической пластичности. После встраивания бычка-кругляка в экосистему Саратовского водохранилища он стал пищевым объектом для таких видов рыб как обыкновенный судак ( Stizostedion lucioperca Linnaeus, 1759) и берш ( Stizostedion volgense Gmelin, 1788). Однако до настоящего времени оставалось неясным влияние неблагоприятных факторов окружающей среды (различного рода загрязнений) на гематологические параметры бычка-кругляка из водоема не являющегося для него материнским.

Многочисленными исследованиями показано, что кровь и сердечнососудистая система рыб, подвергающиеся выраженным функциональным расстройствам и патологическим изменениям при воздействии различных ядов, являются весьма ценными индикаторами состояния особи [28, 2, 12].

Известно, что рыбы очень чувствительны к содержанию в воде химических агентов и отвечают на их присутствие изменениями как в белой, так и в красной крови, даже если их концентрация не превышает ПДК [5, 9, 8], тем более, что действие различных токсикантов может суммироваться и усиливаться (аддитивный и синергический эф-

фект). Ранее было установлено [17], что гематологические параметры бычка-кругляка в условиях Саратовского водохранилища подвержены негативным изменениям под воздействием различных неблагоприятных факторов (в том числе влиянию антропогенных загрязнений) не в меньшей степени, чем подобные показатели крови у аборигенных карповых и окуневых видов рыб.

Таким образом, некоторые показатели крови бычка-кругляка, несмотря на его устойчивость к воздействию комплекса неблагоприятных факторов является надёжным индикатором степени токсичности или нетоксичности водной среды.

Целью настоящей работы явилось изучение некоторых гематологических показателей бычка-кругляка из двух районов Саратовского водохранилища и использование их в качестве одного из критериев экологического состояния данных акваторий.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Для гематологических исследований особей бычка-кругляка вылавливали в районе Мордовин-ской поймы и Васильевских островов Саратовского водохранилища (п. Брусяны, п. Лбище). Сбор материала производился в весенне–летний период 2010 г. Возраст особей определяли по отолитам [22]. Всего изучено 51 особь бычка-кругляка из обоих участков водоема (табл. 1).

Таблица 1. Число обследованных особей бычка-кругляка разного возраста из разных участков Саратовского водохранилища

участок Саратовского водохранилища	Число особей разного возраста, экз.
	2+	3+	4+
п. Лбище (напротив устья р. Чапаевка)	13	12	1
п. Брусяны (18 км. ниже устья р. Чапаевка)	14	11	-

Основную массу выловленных рыб составляли половозрелые особи в возрасте 2+ и 3+, единично встречена особь 4+. Так как изучаемые нами гематологические параметры не зависят от возраста половозрелых рыб, а по рыбам некоторых возрастов выборка нерепрезентативна, то далее мы не разделяем всех особей на возрастные группы.

Кровь отбирали из хвостовой артерии. Мазки крови изготавливали на месте вылова, затем фиксировали их 96° этанолом. После просушки препараты окрашивали по методу Романовского– Гимза. При подсчёте форм эритроцитов и лейкоцитарной формулы использовали оптический бинокулярный микроскоп с иммерсионным объективом. На мазках крови подсчитывали подряд все встречающиеся в поле зрения форменные элементы крови и на специальных бланках отмечали их в зависимости от принадлежности к тем или иным группам. Согласно общепринятой методике [10] подсчёт различных форм клеток начинали с середины мазка, перемещая поля зрения методом зигзага к краю предметного стекла, так как форменные элементы крови из-за их различного удельного веса размещаются на разных участках препарата. В середине мазка, например, среди эритроцитов преимущественно находятся лимфоциты, по краям – нейтрофилы, эозинофилы и т.д. [10]. Для оценки неблагоприятных воздействий на организм животных мы вычисляли соотношение нормобластов и зрелых эритроцитов, соотношение эритроцитов и лейкоцитов, а также применяли Индекс Сдвига Лейкоцитов (ИСЛ), который является в наших исследованиях одним из основных показателей состояния белой крови [8]. Приведён также подсчёт клеток эритроидного ряда с выраженными патологиями. Статистическую обработку полученных данных осуществляли общепринятыми методами [13] с применением программы Excel 2007.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Воды Саратовского водохранилища постоянно содержат различного рода органические и неорганические загрязнители. В исследуемом районе, напротив устья р. Чапаевка, вместе с водостоком этой реки в Саратовское водохранилище поступают характерные для данного района загрязняющие вещества: сульфаты, БПК5, ХПК, азот нитритный, соединения меди, магния, фенолы, альфа- и гамма-ГХЦГ. Вода р. Чапаевка в двух контрольных створах из года в год характеризуется как “грязная” 4 ”А” класса качества. Отмечается стабильное загрязнение воды соединениями меди – до 4 ПДК, азотом нитритным – до 2 ПДК. Среднегодовое содержание трудно окисляемых органических веществ (по ХПК) наблюдалось на уровне 3 ПДК, максимальное превышало 15 ПДК, число превышений норматива было равно 100%. Обнаружено присутствие хлорорганических пес- тицидов. Среднегодовые концентрации превышали условные ПДК: по α-ГХЦГ в 4 раза, по γ-ГХЦГ в 2 раза. Максимальные концентрации превышали условно установленную норму: по α-ГХЦГ – в 20 раз (критерий ЭВЗ), по γ-ГХЦГ – в 9 раз (критерий ЭВЗ) [7]. Вода реки Чапаевка с подобными характеристиками поступает непосредственно в район нашего исследования - п. Лбище, а затем в район Мордовинско-Брусянской поймы Саратовского водохранилища.

Оба района исследования характеризуются сходными экологическими условиями: каменистое дно, скорость течения в прибрежной зоне 0,25 – 0,45 м/с, сходный кислородный режим. Два этих района разделены участком Мордовинско-Брусянской поймы протяжённостью 15-20 км, в акватории которой данный вид рыб не встречается. Район пристани Лбище расположен непосредственно напротив впадения устья р. Чапаевка в Саратовское водохранилище, то есть подвержен непосредственному воздействию загрязнённых вод этой реки. Район пристани Брусяны расположен ниже устья р. Чапаевки на 18 км.

Многообразие функций крови – одной из дифференцированных реактивных тканей – ставит её в ряд ценных индикаторов состояния особи [8]. Дифференцированность крови бесспорна, так как эта ткань состоит из плазмы и различных видов клеток, каждые из которых выполняют свою характерную функцию, соответственно и функции самой крови многообразны (газообмен, трофическая функция, специфические и неспецифические иммунные функции и т.д.). К тому же все без исключения составляющие элементы крови первыми в организме реагируют на те, или иные изменения внешней среды, соответственно очень быстро изменяются и многочисленные гематологические показатели, что является доказательством повышенной реактивности этой ткани. Таким образом, гематологические параметры рыб могут успешно использоваться в качестве одного из показателей в системе комплексного биологического мониторинга водных экосистем [14, 24, 21].

Известно, кровь рыб показательно реагирует на загрязнение водоёмов сточными водами большим разнообразием форм патологических изменений красных клеток крови, чего практически не бывает при инфекционных и инвазионных заболеваниях [12, 17, 21].

На фоне выраженных отклонений в изученных гематологических параметрах у бычка-кругляка из двух участков Саратовского водохранилища нами зафиксировано 13 видов патологий эритроцитов (табл. 2), ранее описанных нами для многих видов рыб из данного района водохранилища [17].

Все обнаруженные виды клеточных патологий встречаются у особей бычка-кругляка независимо от их возраста. Ранее показано, что при усили- вающемся загрязнении водоёма у рыб массово появляются различные патологические формы эритроцитов: деформированные в разной степени клетки, шистоциты, амитотически делящиеся эритроциты, вакуолизированные эритроциты, сморщенные эритроциты и клетки с кариорекси-сом и кариолизисом [12]. Подобную картину мы наблюдаем у бычка-кругляка из Саратовского водохранилища, что является одним из доказа- тельств сильной антропогенной нагрузки на данный водоём.

Наиболее часто встречаемой патологией эритроцитов оказалась деформация клетки – изменение формы клетки без изменения её площади (рис. 1.1б), она обнаружена у 60,78% бычка-кругляка. Количество эритроцитов с данным нарушением в красной крови у некоторых особей достигало 56,00% (табл. 2).

Таблица 2. Встречаемость эритроцитов с различными типами патологий у бычка-кругляка Саратовского водохранилища в 2010 г.

Тип патологии эритроцита	Частота встречаемости аномальных эритроцитов, %
	lim	M	m
Изменение формы клетки	2,25-56,00	19,29	0,24
Сморщивание клетки	4,50-17,75	9,25	0,25
Кариолизис	4,50-8,50	6,58	0,23
Ацентрическое ядро	2,00-9,25	5,47	0,26
Вздутие клетки	1,00-8,50	4,67	0,28
Вакуолизация цитоплазмы	0,50-7,00	2,94	0,31
Веретеновидная деформация	0,50-5,25	2,80	0,31
Каплевидная деформация	0,25-6,75	2,00	0,33
Цитолиз (шистоцитоз)	0,50-0,75	0,63	0,11
Пикноз	0,50-0,75	0,63	0,11
Кариорексис	0,50	0,50	0,50
Деформация ядра	4,50	4,50	4,50
Два ядра	0,25	0,25	0,25

1                                       2

3                                  4

Рис. 1. Некоторые патологии эритроцитов:

1а, 2а, 3б, 4а – эритроциты нормального размера и формы (без патологий); 1б – деформация эритроцита – изменение формы клетки без изменения её площади; 2б – сморщивание эритроцита; 3а – кариолизис; 4б – веретеновидная деформация эритроцита; 4в – ацентрическое ядро

В крови значительного количества рыб обнаруживались такие патологии как сморщивание эритроцита (рис. 1.2б), кариолизис (рис. 1.3а) и ацентрическое ядро (рис. 1.4в). Среднее содержание эритроцитов с подобными нарушениями в красной крови не превышало 9,25% (сморщивание клетки) и 6,58% (кариолизис), однако, для некоторых нарушений было характерно достаточно высокое максимальное содержание патоло- гических эритроцитов в красной крови – 17,75% клеток (сморщивание клетки) (табл. 2).

Вздутие эритроцита, вакуолизация цитоплазмы, веретеновидная деформация эритроцита, каплевидная деформация эритроцита, цитолиз (шис-тоцитоз) и пикноз обнаружены у небольшого количества особей, а доля клеток с этими патологиями в кровяном русле отдельных рыб незначительна. Такие патологии как кариорексис, деформация ядра эритроцита и два ядра в одной клетке у бычка-кругляка зафиксированы единично. Подробное описание всех выше перечисленных нарушений строения клеток неоднократно приведено в литературе [12, 8, 17].

Средние показатели встречаемости эритроцитов с наиболее частыми типами патологий у бычка-кругляка в 2010 г. оказались достаточно высокими, что свидетельствует о неблагополучной экологической обстановке в районах исследования.

Меньше четверти изученных рыб из обоих районов Саратовского водохранилища (21,57±5,81%) не имели клеточных патологий в кровяном русле, то есть являлись здоровыми по данному признаку. В крови 37,25±6,84% особей обнаруживались эритроциты с одним типом патологии. Чаще всего встречались рыбы с двумя и более типами патологий эритроцитов – 41,18±6,96%. Таким образом, общая доля рыб с клеточными патологиями составила 78,43±5,82%, что можно считать одним из доказательств неблагополучия популяции бычка-кругляка в условиях Саратовского водохранилища.

Среди рыб, обитающих в прибрежной зоне исследуемых районов Саратовского водохранилища, доля особей без патологий эритроцитов не превышает 20,51±8,24% в районе п. Лбище и 25,00±13,06% в районе п. Брусяны (рис. 2).

Встречаемость особей с двумя и более видами патологий эритроцитов среди бычка-кругляка несколько меньше в районе п. Брусяны (33,33±14,21%), так как данный район находится на некотором удалении от источника загрязнения. В то время как в районе п. Лбище доля таких особей составляет 43,59±8,04%. Число рыб с одним видом клеточной патологии в красной крови различается в разных районах несущественно (рис. 2).

Другим важным показателем благополучного состояния, как отдельной особи, так и популяции рыб является уровень гемопоэза в красной крови. Ранее успешно оценивалось состояние рыб по количеству эритроцитов [6, 34], по интенсивности процесса гемопоэза [32, 33], по количеству нор-мобластов [27, 29], Особь может условно считаться здоровой по уровню гемопоэза если в красной крови содержится 25,00-35,00% нормобластов. Доказано также, что при воздействии на рыб различных загрязнителей, в частности ртути, коли- чество нормобластов и полихроматофильных эритроцитов (незрелых форм эритроцитов) падает до 0,2%, а основную массу красных клеток составляют зрелые эритроциты – 99,8% [12], то есть качество процесса гемопоэза падает до минимума.

патологий         дву мя и эритроцитов более видами патологий

□ п. Лбище □ п. Брусяны

Рис. 2. Встречаемость половозрелых особей бычка-кругляка из разных районов Cаратовского водохранилища с различным количеством патологий эритроцитов

Таблица 3. Встречаемость особей бычка-кругляка с различным содержанием нормобластов в красной крови

Вид рыб	Содержание нормобластов в красной крови, %
	0,0025,00% (пониженное)	25,0035,00% (норма)	35,0050,00% (повышенное)	> 50,00% (патология)
бычок-	98,04±	1,96±
кругляк	1,96	1,96	-	-

Изучение уровня нормобластов в красной крови бычка-кругляка показало, что в 2010 г. среди обследованных рыб наибольшую часть составляли особи с пониженным содержанием этих клеток в кровяном русле (табл. 3). Это признак пониженного уровня гемопоэза, что может быть вызвано неполным соответствием условий обитания оптимальным. Особь с нормальным уровнем нор-мобластов в крови зафиксирована единично. Таким образом, на разных участках Саратовского водохранилища (п. Лбище и п. Брусяны) в 2010 г. основу популяции составили особи с пониженным уровнем гемопоэза.

Другим важным показателем состояния особи является соотношение клеток эритроидного и лимфоидного ряда крови. Для взрослых рыб нормальным считается содержание в крови белых клеток соответствующее 25 – 35%. Установлено, что у рыб под воздействием различных загрязнений снижается функция иммунитета, по сравнению с таковой у рыб из незагрязнённых участков обитания [21]. Эксперименты на плотве (Rutilus rutilus) показали, что аккумуляция ртути приводит к уменьшению количества лимфоцитов и возрастанию количества моноцитов и нейтрофилов [26]. Аккумуляция кадмия, также вызывает уменьшение количества лимфоцитов, повышение в кровяном русле клеток, обладающих фагоцитарной активностью, и разрушение миелоцитов [25].

Среди всех обследованных особей не зафиксировано ни одной с повышенным или патологически повышенным содержанием лейкоцитов в крови (табл. 4). Однако количество рыб с нормальным уровнем лейкоцитов в кровяном русле не превышает четверти от всех обследованных. Основу популяции бычка-кругляка на обоих изученных участках Саратовского водохранилища составляют особи с признаками лейкопении, что также является признаком повышенной антропогенной нагрузки. Нами не зафиксировано существенных различий по частоте встречаемости особей бычка-кругляка с пониженным и с нормальным содержанием лейкоцитов на разных участках данного водоема. Не выявлено таких различий и для рыб разного возраста (2+ и 3+).

Таблица 4. Встречаемость особей бычка-кругляка с различным содержанием лейкоцитов в кровяном русле

Вид рыб	Содержание лейкоцитов в крови, %
	0,0025,00% (пониженное)	25,0035,00% (норма)	35,0050,00 (повышенное)	> 50,00% (патология)
бычок-	76,47±	23,53±
кругляк	5,99	5,99

Таким образом, большинство особей бычка-кругляка из обоих участков Саратовского водохранилища имеют недостаточное количество лейкоцитов в кровяном русле для нормального функционирования иммунной системы, что является следствием воздействия различных загрязнителей. Многочисленные исследования доказали, что загрязнение окружающей среды влияет на иммунную систему рыб именно таким образом [16, 26, 31].

Надёжным критерием оценки состояния отдельной особи являются также отклонения в лейкоцитарной формуле [12, 1]. В качестве показателя, в некоторой степени подтверждающего условное неблагополучие исследованных видов рыб, мы использовали Индекс Сдвига Лейкоцитов (ИСЛ), который отражает отклонения в гематологических параметрах [8]. Повышение относи -тельного содержания незрелых нейтрофильных клеток в периферической крови называется сдвигом влево. Снижение доли палочкоядерных нейтрофилов и присутствие гиперсегментированных ядер определяется как сдвиг вправо [8]. Иными словами, ИСЛ является отношением гранулоци- тов и агранулоцитов. У разных видов рыб допустимое значение ИСЛ может отличаться; в частности, у большинства рыб семейства Cyprinidae значение ИСЛ равно 0,30 [8].

Для бычка-кругляка Саратовского водохранилища неизвестны значения нормального уровня ИСЛ, поэтому значения условной нормы (0,250,35) [17] вычислены нами из соотношения различных форм гранулоцитов и агранулоцитов, выявленных у рыб здоровых по остальным гематологическим показателям.

Из данных таблицы 5 следует, что основная доля всех обследованных рыб имела повышенный уровень ИСЛ, что обусловлено высоким содержанием гранулоцитов (эозинофилов, нейтрофилов и т.д.) среди лейкоцитов. У бычка-кругляка частота встречаемости таких особей в популяции Саратовского водохранилища достигает 94,12±3,33%. Количество рыб с условно нормальным уровнем ИСЛ среди бычка-кругляка зафиксировано единично в районе п. Брусяны, удалённого от источника загрязнения на 18 км. Невелико и количество особей с пониженным показателем ИСЛ.

Сдвиг показателя ИСЛ в ту или иную сторону от условной нормы является признаком заболевания или усиленного негативного пресса со стороны окружающей среды, а высокая частота встречаемости таких особей является признаком неблагополучия популяции в целом, особенно если велика также доля рыб с ненормальным уровнем нормобластов и лейкоцитов в кровяном русле. В нашем случае количество особей с повышенным значением ИСЛ являлось доминирующим в обоих исследуемых районах Саратовского водохранилища, что является свидетельством высокого уровня загрязнения данных участков акватории.

Таблица 5. Встречаемость особей бычка-кругляка видов с различным уровнем ИСЛ

Вид рыб	Доля особей с различным уровнем ИСЛ, %
	ИСЛ < нормы	0,25-0,35 (условная норма ИСЛ для взрослых рыб)	ИСЛ > нормы
бычок-	3,92±2,74	1,96±1,96	94,12±3,33
кругляк

Повышение показателя ИСЛ является симптомом таких заболеваний как нейтрофилез и эозинофилия. Нейтрофилез вызывается повышением доли нейтрофильных гранулоцитов (окрашивающихся нейтрально, в оттенки серого и светлоголубого цветов) среди лейкоцитов. Эозинофилия является следствием повышения количества эозинофильных гранулоцитов, данные клетки окрашиваются стандартными методами в оттенки красного, ярко-розового и малинового цветов. В норме данные виды гранулоцитов должны содержаться в белой крови, но их количество должно быть в два-три раза ниже, чем количество лимфоцитов, палочкоядерных лейкоцитов и моноцитов, которые являются агранулоцитами.

Из таблицы 6 видно, что у наибольшей части обследованных особей (из числа рыб с повышенным значением ИСЛ) в обоих районах Саратовского водохранилища зафиксированы признаки нейтрофилеза, что является несомненным последствием неблагоприятных внешних воздействий как на отдельных рыб, так и на популяцию в целом.

По мнению некоторых авторов [5, 11, 15, 20, 30] у рыб в большинстве случаев отмечается лейкоцитоз в присутствии каких-либо загрязнителей. При этом наблюдается нейтрофилёз, а остальные показатели весьма разнородны: могут быть как лимфоцитоз, так и лимфоцитопения – пониженное содержание лимфоцитов (табл. 4), как моно-цитоз, так и моноцитопения, эозинофилия или число эозинофилов остаётся неизменным.

Нейтрофилы – активные ферментообразовате-ли, им свойственна и фагоцитарная функция. Нейтрофильный лейкоцитоз со сдвигом влево (в сторону увеличения доли палочкоядерных нейтрофилов) наблюдается, как правило, при оформленных воспалительных процессах и различных интоксикациях [20, 30]. Таким образом, нейтро-филёз можно рассматривать в качестве адаптационного механизма, повышающего защитную функцию крови в условиях воздействия комплекса неблагоприятных факторов [23]. Данный процесс, переходя в длительную или хроническую форму, впоследствии провоцирует различные нарушения во внутренних органах рыб (некрозы, дистрофии и т.д.) [18, 19].

В этом случае повышенное количество рыб с нейтрофилёзом (табл. 6) в обоих участках Саратовского водохранилища (район п. Лбище и район п. Брусяны) можно трактовать как следствие проявления у большинства особей адаптационных реакций в ответ на неблагоприятные факторы среды. Встречаемость некоторого количества особей бычка-кругляка с признаками эозинофилии среди больных рыб, также является признаком неблагополучия особей и популяции в целом.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Согласно полученным результатам, у бычка-кругляка в условиях двух изученных участков 3. Саратовского водохранилища, испытывающих

Таблица 5. Встречаемость бычка-кругляка (среди рыб с повышенным показателем ИСЛ) больных эозинофилией и нейтрофилезом вид Район исследования Встречаемость особей с признаками заболеваний, % эозинофилия нейтрофилез бычок-кругляк п. Лбище 13,16±5,56 86,84±5,56 п. Брусяны 16,67±11,24 83,33±11,24 значительную нагрузку комплекса отрицательных факторов среды, обнаружены патологии в морфологии клеток крови, встречаемость которых высока, и выраженные отклонения в некоторых гематологических параметрах – уровень гемопоэза, соотношение эритроцитов и лейкоцитов, соотношение различных форм лейкоцитов.

Наблюдающиеся у большого числа рыб в 2010 г. нарушения в соотношении клеток красной и белой крови, высокая доля особей с пониженным содержанием лейкоцитов и сдвигом ИСЛ от нормы указывают на сильное воздействие комплекса разных неблагоприятных факторов (в основном антропогенных), которое носит хронический характер. Выявленные гематологические нарушения характерны для половозрелых особей разных возрастов (2+ и 3+), а встречаемость здоровых рыб низка, как в условиях непосредственного воздействия загрязнённых вод, так и на значительном удалении от источника загрязнения.

В силу своей повышенной экологической пластичности бычок-кругляк продолжает успешно конкурировать с аборигенными видами рыб, и за последние десятилетия он полностью освоил свободную экологическую нишу прибрежной литорали Саратовского водохранилища. Однако, комплекс неблагоприятных факторов (в том числе различных видов загрязнений) воздействует на популяции бычка-кругляка не в меньшей степени, чем на популяции аборигенных видов рыб, о чём свидетельствует большая доля половозрелых особей (86,84±5,56% и 83,33±11,24%) в обоих участках водохранилища с повышенным содержанием нейтрофилов в белой крови. Данный факт можно расценивать как проявление активной адаптационной реакции к неблагоприятным воздействиям окружающей среды, так как нейтрофилы выполняют активную фагоцитарную функцию. У половозрелых рыб разных возрастов данные показатели практически не различаются в исследованных участках водоема.

Так как бычок-кругляк становится массовым (зачастую доминирующим) представителем ихтиофауны в прибрежных участках Саратовского водохранилища, а также является подверженным неблагоприятным воздействиям окружающей среды не в меньшей степени, чем аборигенные виды рыб, то его можно считать перспективным объектом-индикатором экологического состояния водоемов.