Ноцицептивная чувствительность крыс с различной прогностической устойчивостью к стрессу

Известно, что стресс (общий адаптационный синдром) - универсальная физиологическая реакция организма на различные сильные воздействия, имеющая детально очерченную морфофункциональную основу в системе прямых и обратных связей между мозговыми структурами и эффекторами, а также, многократно описанные симптомы и фазы [14]. Неоднократно было показано, что возникновение и развитие адаптивных или дизадаптивных реакций в ответ на стрессорные факторы определяются не только силой раздражителя, но и генотипическими особенностями организма [4, 13, 19]. В НИИ нормальной физиологии им. П.К. Анохина для анализа стресс-реактивности подопытных животных в ответ на эмоциональный стресс продолжительный период времени с успехом применяется индивидуальный подход. Экспериментальные результаты с учетом индивидуально-типологических особенностей лабораторных животных отражены в трудах академика Судакова К.В. и его сотрудников [16, 17]. В многочисленных экспериментах обнаружено, что в однотипных условиях животные различаются по степени устойчивости к эмоциональным и иным стрессорным нагрузкам, причем четко выделяются группы устойчивых и предрасположенных к стрессу животных [9]. Как оказалось, наряду с повышенной двигательной активностью в «открытом поле», резистентных к стрессу крыс характеризует увеличенный вес надпочечников, высокое содержание адреналина и кортикостерона в плазме крови, выживаемость в условиях различных стрессорных воздействий [8]. При исследовании содержания нейромедиаторов и нейропептидов в лимбико-ретикулярных структурах мозга, играющих существенную роль, в том числе, в восприятии и проведении болевой импульсации, у таких крыс обнаружено более высокое по сравнению с пассивными животными содержание норадреналина, вещества Р, пептида, вызывающего дельта-сон (ПВДС), и бета-эндорфина в гипоталамусе и более низкий уровень дофамина в области среднего мозга [15]. Существуют и другие физиологические корреляты индивидуальной стресс-реактивности. Так, пассивные в «открытом поле» крысы более склонны к снижению кровотока в коре мозга и летальному исходу при ишемии, вызванной двусторонней окклюзией сонных артерий [7].

Для выявления степени устойчивости и предрасположенности к стрессу в экспериментальных условиях применяются различные подходы. Одни из них основаны на определении гормональной активности организма, другие на учете показателей сердечно-сосудистой системы или функциональной активности клеток крови [2, 10, 18]. Распространенным и удобным способом оценки стресс-реактивности является регистрация поведенческих особенностей крыс в тесте «открытое поле». С использованием данной методики неоднократно было показано, что индивидуальная чувствительность к эмоциональному стрессу коррелирует с количественными показателями ориентировочно - исследовательского поведения животных [9, 24].

В тоже время, обнаружено, что в популяциях лабораторных животных встречаются особи, обладающие различной чувствительностью к ноцицептивным раздражителям: как высоко-, так и низкопороговые особи [1]. В ряде исследований отмечено влияние генотипа на болевую чувствительность [21, 23, 25]. Индивидуально - типологические особенности болевой чувствительности, как людей, так и лабораторных животных в настоящее время являются предметом пристального внимания в анализе механизмов развития хронической боли [20, 21].

Хорошо известно, что и болевые, и стрессор-ные факторы различной модальности в начале своего действия на организм инициируют, прежде всего, адаптивные, защитные механизмы, восстанавливающие нормальные показатели гомеостаза, нивелирующие последствия повреждений и оптимизирующие уровень метаболизма. При этом, течение процессов двигательного, мотивационного, когнитивного, эмоционального и вегетативного характера, сопровождающих проявления ответных ноцицептивных и стрессорных реакций во многом задается генетически предопределенными свойствами ЦНС отдельных особей [5]. В этом случае, представляется интересным рассмотреть возможную взаимозависимость болевой и стрессорной реактивности. В связи с этим, целью данного исследования явилась оценка ноцицептивной чувствительности крыс с учетом индивидуально-типологических особенностей поведения животных в «открытом поле».

Методика исследования.

Результаты исследования являются отражением интегративных данных, полученных в экспериментах многих лет в лаборатории системных механизмов боли по изучению различных аспектов ноцицепции, в которых обязательно осуществлялась регистрация поведенческой активности и фоновых болевых порогов.

Эксперименты проведены на 182 крысах-самцах линии Wistar массой 220-300 г. Крыс содержали в виварии при температуре 20-22оС на стандартном пищевом рационе в искусственных условиях освещения (9:00-21:00 - свет, 21:00-9:00 - темнота). При проведении опытов руководствовались «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденными на заседании этической комиссии ГУ НИИ нормальной физиологии им. П.К. Анохина РАМН (протокол №1 от 3.09.2005), требованиями Всемирного общества защиты животных (WSPA) и Европейской конвенции по защите экспериментальных животных.

Стресс-реактивность крыс оценивали по интегративному показателю двигательной активности – индексу активности (ИА) [9]. С целью его определения животных в течение 5 минут тестировали в освещенном круглом «открытом поле» диаметром 90 см, разделенном на 37 секторов. На полу «поля» были размещены 8 столбиков диаметром 4 см и высотой 14 см. Регистрировали следующие параметры поведения животных: латентный период (ЛП) первого перемещения, ЛП выхода в центр, количество пересеченных периферических и центральных секторов (горизонтальная активность), количество периферических и центральных стоек (вертикальная активность) и исследовательскую активность (обнюхивание столбиков). Для вычисления ИА животных сумму числа пересеченных ими периферических и центральных секторов, периферических и центральных стоек, а также исследованных объектов (суммарная горизонтальная и вертикальная активность) делили на сумму латентных периодов первого движения и выхода крыс в центр «открытого поля» [9].

Уровень ноцицептивной чувствительности у животных с различной прогностической устойчивостью к стрессу оценивали на следующий день после определения показателей двигательной активности в «открытом поле» с помощью анальгезиметра Ugo Basile (model – DS20, Italy) по стандартной методике «tail flick» с определением латентного периода реакции отведения хвоста (ЛП РОХ) в ответ на светотермальное раздражение. Для стандартизации условий экспериментов и необходимого периода адаптации животные, размещенные в пластиковых боксах, в течение 30 минут до тестирования находились под электрической лампой, обеспечивающей постоянное и комфортное сохранение температуры тела, и особенно хвоста. Регистрация исследуемого ноцицептивного показателя осуществлялась у каждой крысы 5 раз с интервалом 3-5 минут и последующим расчетом среднего значения ЛП РОХ в секундах.

Статистическую обработку данных проводили с помощью стандартных статистичеких методов, входящих в пакеты прикладных программ Excel с использованием параметрического t-критерия Стьюдента. Принятый уровень значимости межгрупповых отличий составлял 5%. Числовые данные приведены как среднее значение ± ошибка среднего.

Результаты и обсуждение:

Как было установлено ранее, поведенчески активные в «открытом поле» животные прогностически более устойчивы к отрицательным последстви- ям стрессорных воздействий по сравнению с пассивными особями [8, 9, 16]. Но при этом, анализ взаимосвязей между поведенческой активностью и устойчивостью животных к стрессу, практически всегда, осуществлялся только у представителей крайних группировок: резистентных и предрасположенных к стрессу крыс. Животные со «средними показателями» поведения в «открытом поле» из работ выбраковывались. В данном исследовании мы сохранили амбивалентных «середняков» и рассматривали зависимость ноцицептивной чувствительности от стресс-реактивности отдельных особей в общем популяционном масштабе.

Регистрируемые нами показатели двигательной активности крыс в «открытом поле» послужили для расчета ИА, отражающего стресс-реактивность животных следующим образом: чем больше значение этого индекса по отношению к единице, тем выше устойчивость животных к стрессу, и наоборот, чем меньше ИА по сравнению с единицей, тем ниже эта устойчивость. Согласно этому, исследование характеристик поведения крыс в «открытом поле» позволило разделить животных на 3 группы (устойчивых, предрасположенных к стрессу и амбивалентных особей) по следующим критериям. К стресс-резистентным животным были отнесены крысы, обязательно выходящие в первые 20 секунд тестирования в центр «поля», с коротким ЛП первого перемещения (< 3 cекунд), c высокой двигательной активностью (число пересеченных секторов >130), большим числом вертикальных стоек (>10) и исследованных объектов (>8). В результате в 1 группу вошли 28 резистентных к стрессу крыс, ИА которых варьировал в широком диапазоне от 1,5 до 7,5.

В группу стресс-предрасположенных крыс были отнесены 55 особей, никогда не выходившие в центр «открытого поля», у которых были отмечены продолжительный ЛП первого движения (> 10 секунд) и общая низкая двигательная активность. Число пересеченных секторов «поля» у них не превышало 50, и практически отсутствовала исследовательская активность, что, в свою очередь, сопровождалось минимальным количеством вертикальных стоек (< 4). ИА у этих животных был менее 0,7 и достоверно (P<0,01) отличался от данного показателя у резистентных крыс. В нередких случаях, ИА у них «стремился» к 0, из-за чрезвычайно продолжительного ЛП первого движения и общего малого числа двигательных актов.

Третью, самую многочисленную группу составили 99 амбивалентных животных со «средними» значениями ИА, колебавшегося в пределах от 0,8 до 1,4. Крысы из этой группы также демонстрировали менее выраженную двигательную активность по сравнению с резистентными особями (число пересеченных секторов < 130, а количество вертикальных стоек и исследованных объектов, как правило, было в разы меньше, чем у представителей из первой группы). Редкие случаи выхода в центр «поля» отдельными крысами осуществлялись большей частью через 40 и более секунд после начала тестирования.

При регистрации ноцицептивного показателя были зафиксированы максимальные его значения у животных из группы резистентных и группы предрасположенных к стрессу крыс, 8,7+1,2 сек. и 9,3+2,1 сек. соответственно. Амбивалентные животные в основном демонстрировали более высокий уровень ноцицептивной чувствительности, ха-рактеризирующийся относительно меньшими значениями ЛП РОХ (6,3+1,4 сек.) по сравнению с особями из других групп.

Таким образом, при анализе показателей двигательной активности у стресс-резистентных крыс обнаружена прямая зависимость между значениями ИА и ЛП РОХ. Удивительным образом, у стресс-предрасположенных животных выявлена обратная тенденция. То есть, и те, и другие оказались высоко-пороговыми особями. Животные же со «средними» значениями ИА, и соответствующими показателями двигательной активности, обнаружили максимальный уровень ноцицептивной чувствительности, достоверно отличный (P<0,05) от его значений у крыс из первых 2-х групп.

Полученные нами данные, отчасти, согласуются с результатами исследования, в котором рассматривалось влияние иммобилизационного стресса (обездвиживание на спине) на функциональные показатели крыс с разными порогами болевой чувствительности [3]. Острый иммобилизационный стресс у крыс с высокой чувствительностью к боли вызывал более значительные изменения основных функциональных систем организма, чем у высокопороговых животных. Все это выражалось в более значимой гипотензии, брадикардии, снижении температуры тела, частоты дыхания и потребления кислорода, нарушении кислотно-основного равновесия с признаками лактацидоза, из чего следовал вывод, что крысы с низкой чувствительностью к боли обладают большей устойчивостью к острому стрессовому воздействию, чем низко-пороговые животные. В целом это подтверждает важное значение индивидуальной болевой чувствительности для формирования устойчивости организма к стрессу.

Как неоднократно было показано, порог болевой чувствительности у представителей одной популяции, имея широкий диапазон варьирования, характеризуется относительной симметричностью распределения вариант с накапливанием их в центральных классах и постепенным убыванием по мере удаления от центра ряда. Это указывает на характерную общебиологическую закономерность нормального распределения свойств данного показателя, как у человека, так и у животных [12]. При этом, порог болевого ощущения, также как и уровень стресс - реактивности, является жизненно важной константой, необходимой для адекватного существования организма, закрепленной генетически [5, 20]. Поэтому, весьма вероятно, что существует взаимосвязь особенностей зоо-социального статуса отдельных особей, отражаемого в характере исследовательского поведения в «открытом поле», и сочетанных с ними изменений уровня ноцицепции. Направленность таких сопряженных реакций, прежде всего, может зависеть от типа эмоционального реагирования на стрессорные и болевые факторы. Стенические эмоции, преобладающие у резистентных к стрессу животных, составляющих популяционный численный минимум, и направленные на активное преодоление стресс-индуцируемой и болезнетворной ситуации, снижают аффективноперцептуальный компонент боли [11]. Активные в «открытом поле» крысы, по существу, являются животными-лидерами, чья повседневная жизнь в большинстве случаев представляет собой постоянное утверждение своего главенствующего иерархического положения в схватках с менее успешными соплеменниками. Поэтому, сниженный уровень болевой чувствительности, жизненно необходимый им для постоянного самоутверждения, в том числе, может являться следствием более высокого содержания в гипоталамусе отдельных олигопептидов, таких как бета-эндорфин, ПВДС и субстанция Р [15].

Напротив, астенические эмоции, сопровождающие стратегию пассивного избегания разнообразных трудностей, свойственную «подчиненным» особям, могут приводить к снижению порога боли, коррелирующему с уровнем тревоги или депрессии. Повышение уровня ноцицепции, в свою очередь, часто сопровождается снижением сексуального, пищевого и локомоторного поведения [11]. Но тогда вероятно, что повышенный уровень болевой чувствительности у амбивалентных крыс, представляющих численное большинство, в таком случае, отражает их потенциальную готовность более активно уходить от опасности повреждения. Чем быстрее у таких представителей возникает болевое ощущение, тем быстрее и адекватнее формируется у них интегративная функциональная система боли, инициирующая включение защитных механизмов во имя избавления от нее и сохранения целостности покровных оболочек.

Животные, определенные нами как предрасположенные к стрессу, вероятно, являются особями-жертвами, которые в силу особенностей своего поведения не могут ни сопротивляться, ни активно избегать действия повреждающих факторов. Высокий ЛП РОХ у них, таким образом, может являться отражением сильного эмоционального напряжения, связанного с иммобилизацией в пластиковых домиках, и стресс-индуцированной анальгезией, опосредуемой, прежде всего, активированной эндогенной адренергической антиноцицептивной системой.

Таким образом, характер сопряженных поведенческих и ноцицептивных реакций при эмоцио- нальном стрессе может зависеть от особенностей зоо-социального положения животного. Сочетанные уровни устойчивости животных к стресс-факторам и повреждающим воздействиям определяются сложными, генетически обусловленными особенностями нейрохимических процессов в ЦНС, в основе которых лежит специфическая организация молекулярных и нейрохимических свойств нервных клеток эмоциогенных гипоталамо - лимбико-ретикулярных структур.