Новая лиопротекторная среда для лиофилизации несимбиотических азотфиксирующих бактерий, перспективных для производства биоудобрений

Введение. Одним из важнейших направлений биологизации сельского хозяйства является замена химических удобрений на микробиологические – в первую очередь на биопрепараты на основе азотфиксирующих микроорганизмов [1–3]. При этом при выборе штаммов для производства биопрепаратов предпочтение следует отдавать автохтонным, выделенным из местных почвенных и ризосферных сообществ и, соответственно, эволюционно адаптированных к местным почвенно-климатическим условиям и способным эффективно функционировать в данном сообществе [4].

Ключевой проблемой при практическом использовании штаммов в биотехнологических процессах, включая производство микробиологических удобрений, является их сохранение в микробиологической коллекции. Сохранение штаммов методом регулярных пересевов на свежую питательную среду, помимо высокой трудоемкости, несет риски утраты штаммом полезных свойств в результате автоселекции, а также контаминации культуры посторонними микроорганизмами. В этой связи наиболее надежным способом длительного сохранения штаммов микроорганизмов в жизнеспособном состоянии является лиофилизация, то есть сублимационное высушивание микробных культур из замороженного состояния [5, 6]. Ключевой и до сих пор нерешенной проблемой лиофилиза- ции является повреждение микробных клеток на различных стадиях процесса лиофилизации, приводящее к утрате ими жизнеспособности. Для снижения гибели микробных клеток при лиофилизации применяют разнообразные защитные (лиопротективные) среды, состав которых для каждого микроорганизма подбирают эмпирически [7].

В ходе выполнения научно-исследовательской работы по тематическому плану-заданию по заказу Минсельхоза РФ за счет средств федерального бюджета «Разработка комплексного биопрепарата для защиты пшеницы от фуза-риоза и улучшения обеспеченности пшеницы азотом в условиях Сибири» из почвы местного агроценоза нами был выделен быстрорастущий штамм азотфиксирующих бактерий OSV-2, по совокупности культурально-морфологических свойств идентифицированный как представитель р. Azotobacter .

Цель исследований – подбор защитной среды для лиофилизации азотфиксирующего штамма OSV-2, обеспечивающей приемлемое с точки зрения сохранения штамма выживание микробных клеток.

Задачи: проверка возможности сохранения жизнеспособности штамма OSV-2 при лиофилизации без использования защитных сред, с использованием стандартных защитных сред; разработка защитной среды, обеспечивающей повышенное выживание клеток в сравнении со стандартными средами.

Объекты и методы. Штамм представляет собой аспорогенные грамотрицательные аэробные палочки; при выращивании на жидкой среде в молодой культуре – подвижные. Клетки плеоморфные, от коротких палочковидных до округлых, одиночные, в парах, в тетрадах и в неправильных скоплениях, редко – в коротких цепочках. При старении культуры склонны к образованию слизистой капсулы; клетки под капсулами кокковидные, могут достигать больших размеров; размер палочковидных клеток 2,6–4,2×2,1–3,5 мкм; диаметр кокковидных клеток без капсул 1,8–2,5 мкм; диаметр кокковидных клеток под капсулами 2,6–4,0 мкм (рис. 1).

Рис. 1. Клетки штамма OSV-2 (длина масштабной полоски 10 мкм)

Колонии в молодой культуре округлые бесцветные морщинистые, в более старой культуре – бесцветные слизистые.

Штамм хорошо растет на безазотистой среде Эшби с маннитом в качестве источника углерода и с микросолями по Федорову, а также на среде № 2 ГРМ (Сабуро) производства ФБУН ГНЦ ПМБ, разведенной в 2 раза и дополненной агаром до 15–20 г на 1 л среды.

Штамм выращивали в чашках Петри на среде № 2 ГРМ (Сабуро), разведенной в 2 раза и дополненной агаром до 20 г/л при 25 °С в течение 7 сут, после чего суспендировали клетки в одной из защитных сред и лиофилизировали в лиофильной сушилке Bio-Rus-4SFD следующем режиме: стадия замораживания при -36 °C в течение 5 ч; основная сушка при -40 °C в течение 15 ч при давлении 60 Па; вторичная сушка с шагом от 5 до 15 °C при давлении 80 Па в течение 5 ч [8, 9].

В качестве стандартных защитных сред использовали среду Файбича (сахарозо-желатиновый агар) и среду Файбича с 1% аскорбиновой кислоты в качестве антиоксиданта [10]. Выбор среды Файбича обусловлен тем, что она широко используется в России в качестве лиопротектора [11] и, в частности, является основной средой для лиофилизации бактерий и дрожжей в крупнейшей в России по разнообразию поддерживаемых культур Всероссийской коллекции микроорганизмов на базе Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук [12]. В качестве новой защитной среды использовали разработанную авторами на основе анализа литературных данных композицию следующего состава: пептон ферментативный сухой – 3,2 г; сахароза – 10 г; глицерин – 10 мл; вода дистиллированная – 90 мл.

Контролем служили клетки, суспендированные в дистиллированной воде без добавления лиопротекторов.

Определение жизнеспособности выживших клеток проводили прямым методом. Суспензию лиофилизированных клеток наносили на агари-зованную питательную среду и инкубировали при температуре 25 °С. После 12 ч инкубирования определяли соотношение выживших и мертвых клеток с помощью фазово-контрастной микроскопии in situ с последующим подтверждением способности клеток к формированию микроколоний через 24 и 36 ч инкубирования после посева (рис. 2). Долю выживших клеток определяли как отношение числа микроколоний к сумме погибших клеток и микроколоний на поверхности среды.

Рис. 2. Погибшие (1), выжившие (2) при лиофилизации клетки и формирование микроколонии (3) выжившими при лиофилизации клетками азотфиксирующего штамма;

длина масштабной полоски 10 мкм

Результаты и их обсуждение. Максимальное выживание клеток изучаемого штамма (12,89 %) отмечено при использовании разработанной авторами композиции на основе пепто- на, сахарозы и глицерина. На втором месте по выживаемости – среда Файбича (9,92 %), на третьем – контроль без лиопротекторов (8,04 %) (рис. 3).

Рис. 3. Выживаемость клеток азотфиксирующего штамма при лиофилизации с использованием защитных сред

Статистическая значимость различий между указанными вариантами по выживаемости клеток, согласно тесту χ2, составляет p < 0,05.

В противоположность указанным вариантам в варианте с использованием среды Файбича с 1 % аскорбиновой кислотой выживших клеток не обнаружено (рис. 4).

При дальнейшем инкубировании микроколонии в вариантах, лиофилизированных без лио-протекторов (контроль), а также при использовании в качестве защитных сред среды Файби-ча и авторской композиции, нормально развивались; в варианте со средой Файбича с 1% аскорбиновой кислоты рост отсутствовал (рис. 5).

Рис. 4. Характерный вид культуры на питательной среде после лиофилизации с использованием разных защитных сред: 1 – контроль; 2 – среда Файбича; 3 – среда Файбича с аскорбиновой кислотой; 4 – авторская композиция; видны одиночные нежизнеспособные клетки и микроколонии (показаны стрелками)

Рис. 5. Характерный вид культуры на питательной среде после лиофилизации с использованием разных защитных сред после 36 ч инкубирования: 1 – контроль, 2 – среда Файбича, 3 – среда Файбича с аскорбиновой кислотой, 4 – авторская композиция

Таким образом, разработанный нами состав защитной среды обеспечивает при лиофилизации повышение выживаемости несимбиотического азотфиксирующего штамма, перспективного для применения в качестве микробиологического удобрения в условиях Сибири, в 1,3 раза в сравнении со стандартной защитной средой Файбича.

Следует отметить, что достигнутая нами выживаемость клеток (12,89 %) при лиофилизации может считаться очень хорошим показателем. Известно, что бактерии, образующие полисахаридную капсулу (к которым относится и использованный в работе штамм Azotobacter sp.), плохо переносят лиофилизацию. Так, максимальное число выживших после лиофилизации с использованием желатин-сахарозной, молочноглюкозной и молочной защитных сред клеток у разных штаммов Azotobacter chroococcum варьировало от 8,0×10³ до 1,2×10⁶ при стартовой численности суспензии 10⁹–10¹⁰ клеток, то есть максимальная выживаемость не превышала 0,1 % [13]. Есть основания полагать, что дальнейшая оптимизация разработанной нами смеси на основе пептона, сахарозы и глицерина позволит дополнительно усилить ее лиопротекторные свойства.

Заключение

• 1.    Разработанная нами лиопротекторная композиция на основе пептона, сахарозы и глицерина применительно к изучаемому штамму Azotobacter sp. по своим защитным свойствам в 1,3 раза превышает рекомендованную Всероссийской коллекцией микроорганизмов среду Файбича.

• 2.    Введение в среду Файбича 1 % аскорбиновой кислоты в качестве антиоксиданта, в соответствии с рекомендациями М.М. Файбича, ведет к полной гибели клеток изучаемого штамма при лиофилизации.