Новые подходы в области стандартизации сырья и препаратов черники обыкновенной

Черника обыкновенная (Vaccinium myrtil-lus L.) – многолетний низкорослый кустарничек семейства Вересковых (Ericaceae), произрастающий преимущественно в умеренных и северных регионах Российской Федерации [4]. Воздушно-сухие плоды черники обыкновенной применяются в РФ в качестве вяжущего, противовоспалительного и противодиарейного средства [3, 4], однако в настоящее время большая популярность плодов черники обыкновенной связана с высоким содержанием в них антоцианов (флавоноиды) – биологически активных соединений (БАС), обладающих антиоксидантной, капилляроукрепляющей активностью, способностью улучшать кровоток сетчатки глаза [3, 4, 10]. Следует отметить, что большинство лекарственных средств на основе плодов черники обыкновенной на фармацевтическом рынке РФ представлены дорогостоящими зарубежными препаратами («Мир-тилене форте», «Стрикс», «Витрум Вижн форте»), несмотря на достаточно обширный ареал черники в нашей стране [2, 3].

R OH HO        O+ R 1 OH OH	Антоцианидины плодов черники	R	R 1
	цианидин	ОН	Н
	дельфинидин	ОН	ОН
	мальвидин	ОСН 3	ОСН 3

Преобладание импортных препаратов черники обыкновенной в значительной степени может быть обусловлено несовершенством стандартизации исходного сырья. Известно, и в ходе наших исследований подтверждено, что потери антоцианов при сушке по принятой схеме (провяливание в течение 2-3 ч при

температуре 35-40ºС, а затем досушивание при температуре 55-60ºС) могут достигать 50-60% [6, 11]. В связи с этим в Европейской Фармакопее имеются отдельные монографии на свежие и воздушно-сухие плоды черники, регламентирующие содержание соответственно антоцианов и дубильных веществ [8], хотя используемые в них методики анализа не лишены недостатков. В Российской Федерации существует фармакопейная статья только на воздушно-сухие плоды черники обыкновенной [1], однако и в ней отражены далеко не все показатели качества, предъявляемые в соответствии с ОСТ 91500.05.001-00 «Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения» к фармакопейным статьям на лекарственное растительное сырье [5]. В частности, не нормируется содержание действующих веществ, а качественный анализ представлен пробирочными реакциями.

На наш взгляд, стандартизацию и воздушно-сухих, и свежих плодов черники обыкновенной целесообразно осуществлять по содержанию антоцианов. Это связано с тем, что антоцианы плодов черники являются по сравнению с дубильными веществами более лабильной группой БАС, легко разрушающихся под действием света, высокой температуры, высоких значениях рН [10]. Следовательно, уровень содержания антоцианов в плодах черники обыкновенной может быть надежным критерием подлинности качества и препаратов на его основе данного сырья.

Цель работы: исследование по обоснованию новых подходов к стандартизации сырья и препаратов черники обыкновенной.

Материалы и методы. В исследовании использовали тонкослойную хроматографию (ТСХ), адсорбционную жидкостную колоночную хроматографию и метод спектроскопии в УФ- и видимой области спектра. В методе ТСХ разделение проводили на пластинках «Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ». Регистрацию спектров проводили с помощью спектрофотометра «Specord 40» (Analytik Jena) в диапазоне длин волн 190-700 нм.

Результаты и их обсуждение. В ходе предварительного изучения химического состава плодов черники обыкновенной методом адсорбционной жидкостной колоночной хроматографии нами был выделен ряд веществ антоциановой природы. Были измерены электронные спектры поглощения этих соединений в УФ- и видимой области спектра, рассчитан удельный показатель поглощения доминирующего антоциана (цианидин-3-О-глюкозида) при аналитической длине волны 546 нм в 96% этиловом спирте, содержащем 1% хлористоводородной кислоты, который составил 100±4,3, что соответствует значению, указанному в одном из литературных источников [9]. При этом следует отметить противоречивость данных относительно значения удельного показателя поглощения цианидин-3-О-глюкозида, указанного в различных литературных источниках, в том числе в Европейской фармакопее и Государственной Фармакопее СССР XI издания в фармакопейной статье на цветки василька синего [1, 8].

Метод электронной спектроскопии может быть использован для определения подлинности сырья благодаря наличию максимумов поглощения в УФ- и видимой области спектра, характерных для растворов индивидуальных антоцианов и извлечений из сырья. В ходе исследования нами было выявлено, что кривые поглощения в УФ- и видимой области спектра водно-спиртовых извлечений из воздушно-сухих плодов, высушенных по стандартной схеме, и свежих плодов значительно отличаются (рис. 1). Соотношение оптических плотностей в УФ-области и в видимой области спектра водно-спиртового извлечения из плодов черники свежих (А 282 /А 546 ) соответствует спектральным характеристикам цианидин-3-О-глюкозида и составляет примерно 1,0:1,5 (рис. 1). Для воздушно-сухих плодов это соотношение изменяется в пользу коротковолнового максимума и составляет 1,0:0,10÷0,15. Следовательно, данные спектроскопического анализа необходимо дополнять другими методами, подтверждающими подлинность сырья. Одним из универсальных методов для идентификации большинства биологически активных веществ лекарственных растений является хроматография в тонком слое сорбента благодаря своей специфичности, экономичности, экспрессности.

Для качественного анализа плодов нами предложено проводить разделение в системе н-бутанол – ледяная уксусная кислота – вода (4:1:2) с детекцией в видимой области спектра. На хроматограмме извлечения из свежих плодов черники обыкновенной обнаруживаются пятна розового цвета с величиной R f около 0,51 и 0,47 (гликозиды мальвидина), фиолетового цвета с R f 0,36 (доминирующего соединения – цианидин-3-глюкозид) и пятна синего цвета с R f 0,20 и 0,33 (гликозиды дельфинидина) (рис. 2). Принимая во внимание то обстоятельство, что состав антоцианов воздушносухих и свежих плодов черники обыкновенной имеет как общие, так и отличительные признаки, в качестве диагностических компонентов следует считать наличие цианидин-3-О-глюкозида (R f 0,36) и мальвидин-3-О-глюкозида (R f 0,51). Результаты данных исследований свидетельствуют о целесообразности использования ТСХ для идентификации плодов черники обыкновенной, имеющих характерный набор антоцианов (рис. 2).

Рис. 2. ТСХ–анализ: система н-бутанол – ледяная уксусная кислота - вода (4:1:2) : 1 – спиртовое извлечение из воздушно-сухих плодов черники; 2 – спиртовое извлечение из плодов черники свежих; 3 – мальвидин-3-О-глюкозид; 4 – цианидин-3-О-глюкозид; 5 – дельфинидин-3-О-глюкозид

Рис. 1. Спектры поглощения водно-спиртового извлечения из свежих плодов черники обыкновенной (1), воздушно-сухих плодов черники обыкновенной (2) и цианидин-3-О-глюкозида (3) в 95% этиловом спирте, содержащем 1% НСl

Сравнительное хроматографическое исследование в тонком слое сорбента водноспиртовых извлечений, полученных из свежих плодов черники обыкновенной, а также плодов, высушенных при комнатной температуре, при температуре 40±2°С и по стандартной схеме, показало, что сушка при температуре до 45°С не влияет значительно на качественный состав антоцианов плодов. На основании полученного значения удельного показателя поглощения определены оптимальные условия экстрагирования антоцианов из свежего (свежезамороженного) и воздушно-сухого сырья и разработаны методики количественного определения антоцианов в плодах. Сравнилась экстракционная способность спиртов различных концентраций, влияние рН, температуры, соотношения сырье: экстрагент и времени экстрагирования. Условия для извлечения антоцианов из свежих плодов черники обыкновенной (96% этиловый спирт, содержащий 1% хлористоводородной кислоты; 30 минут на кипящей водяной бане) отличаются от определенных нами оптимальных условий для извлечения антоцианов из воздушно-сухого сырья (60% спирт, содержащий 1% хлористоводородной кислоты; время извлечения 90 мин), что возможно связано с особенностями экстрагирования веществ из сухого и свежего сырья. Содержание антоцианов в воздушно-сухом сырье в подобранных условиях экстрагирования составило 3,35±0,17%, в свежезамороженном – 4,05±0,18% (18,4±0,8% в пересчете на абсолютно сухое сырье). В связи с этим целесообразно использовать в качестве исходного сырья в производстве лекарственных препаратов на основе черники обыкновенной свежее или свежезамороженное сырье или плоды, высушенные до 45°С. В качестве лекарственного препарата нами исследован сироп, полученный из плодов черники свежих. Для стандартизации сиропа черники с целью гармонизации и унификации методик анализа для сырья и препаратов нами также был использован метод прямой спектрофотометрии в видимой области спектра.

Методика количественного определения суммы антоцианов в свежих (свежезамороженных) плодах черники. Около 1 г (точная навеска) размороженных плодов черники помещают в коническую колбу со шлифом вместимостью 100 мл, добавляют 50 мл 95% этилового спирта, содержащего 1% хлористоводородной кислоты. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на тарирных весах с точностью до ±0,01 г. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 минут. Затем колбу охлаждают до комнатной температуры в течение 30 минут, закрывают той же пробкой, снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент 95 % этиловым спиртом, содержащим 1% хлористоводородной кислоты. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр (марки «Красная лента»). 1 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу на 25 мл и доводят до метки 1 % раствором хлористоводородной кислоты в 95% этиловом спирте. Оптическую плотность измеряют в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 546 нм. В качестве раствора сравнения используют 95% этиловый спирт.

Содержание суммы антоцианов в плодах черники свежих в процентах (Х) в пересчете на цианидин-3-О-глюкозид вычисляют по формуле:

Х = A*25*50 m*1*100 , где А – оптическая плотность испытуемого раствора, m – масса сырья, г; 100 – удельный показатель поглощения выделенного антоциана.

Результаты статистической обработки проведенных опытов показывает, что ошибка единичного определения суммы антоцианов в плодах черники с доверительной вероятностью 95% составляет 4,54±0,18%.

Методика количественного определения суммы антоцианов в воздушно-сухих плодах черники обыкновенной. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 3 мм, но не проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 1 г измельченного сырья (точная навеска) помещают в коническую колбу со шлифом объемом 100 мл, добавляют 50 мл 60% этилового спирта, содержащего 1% хлористоводородной кислоты. Далее процесс осуществляют в соответствии с вышеизложенной методикой. С использованием разработанной методики был проанализирован ряд промышленных образцов сырья, представленных на фармацевтическом рынке Самарской области (производства ООО ПКФ «Фитофарм» и ЗАО «Иван-Чай»). Содержание суммы антоцианов в исследуемых образцах варьирует от 4,04 до 4,79%.

Методика определения суммы антоцианов в сиропе черники. Около 1,0 г препарата (точная навеска) помещали в мерную колбу объемом 50 мл, доводят до метки 70% этиловым спиртом, содержащим 1% хлористоводородной кислоты. В качестве раствора сравнения 70% этиловый спирт, содержащий 1% НСl. Оптическую плотность измеряли при длине волны 538 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.

Содержание суммы антоцианов в препарате рассчитывали по формуле:

Х = А*50 = А а*100 2а , где А – оптическая плотность полученного раствора; а – масса пробы, взятой на анализ; 100 – удельный показатель поглощения циани-дин-3-О-глюкозида при 538 нм в 70% этиловом спирте, содержащем 1% хлористоводородной кислоты.

Таким образом, в ходе исследования усовершенствованы и унифицированы методы стандартизации сырья и препаратов черники обыкновенной. Разработанные методики могут быть включены в фармакопейные статьи на плоды черники обыкновенной свежие и воз-дущно-сухие, а также в нормативную документацию на препараты.

Выводы:

• 1.    Определены оптимальные условия сушки плодов черники обыкновенной, необходимые для сохранения качественного состава антоцианов плодов.

• 2.    Предложены рациональные подходы к выбору исходного лекарственного растительного сырья (плодов черники обыкновенной) для производства лекарственных препаратов для улучшения функционального состояния сетчатки глаза. Результаты исследования позволяют сделать вывод о предпочтительности свежего сырья перед воздушно-сухим как источника антоцианов.

• 3.    Разработаны методики качественного анализа плодов (тонкослойная хроматография, электронная спектроскопия), позволяющие идентифицировать плоды и подтвердить их подлинность, а также методики количественного определения антоцианов методом прямой спектрофотометрии, которые позволят унифицировать стандартизацию сырья и препаратов по содержанию действующих веществ.