О диагностической ценности теста по выявлению секреторных IgА для подтверждения отсутствия циркуляции вируса ящура

Известно, что секреторные иммуноглобулины А (sIgA) обеспечивают первую линию защиты против многих возбудителей инфекций (1). В секретах sIgA, связавшись с бактериями и вирусами, предотвращают их адгезию на поверхности слизистой оболочки, а в высоких концентрациях блокируют прикрепление вируса к клеточной стенке. В то же время низкие концентрации полимерных sIgA способны ингибировать внутриклеточную репликацию вируса, не оказывая при этом заметного влияния на его адгезивные свойства. sIgA служат медиатором нейтрализации вирусов (после нейтрализации вируса sIgA, возможно, способствуют элиминации вируса), а также стимулируют фагоцитоз, обеспечивая тем самым местную резистентность к инфекции. Предполагается, что увеличение содержания sIgA в крови связано не только с повреждением эпителия, но и с усилением его образования в поврежденных органах (2). Информация о разработке тестов, предназначенных для обнаружения специфических sIgA, свидетельствует о возможности применения этого феномена в комплексе мониторинговых исследований в отношении ящура (3, 4).

В России среди оперативных и превентивных мер борьбы с ящуром как особо опасной для животноводства инфекцией доминирует вакцино-профилактика. Однако не исключены случаи развития субклинической инфекции, вызванной вирусом ящура (ВЯ) у иммунных животных, которые впоследствии становятся вирусоносителями. В связи с этим вирусоносители составляют потенциальную угрозу для восприимчивых животных, поэтому возникает необходимость их идентификации и изоляции, чтобы исключить дальнейшее распространение инфекции (5).

Для выявления животных-вирусоносителей референтным считается метод выделения вируса ящура из проб пищеводно-глоточной жидкости (ПГЖ) в чувствительных культурах клеток (6). Однако острая фаза репликации вируса может быть непродолжительной при отсутствии клинических признаков, поэтому вероятность его обнаружения мала. Для выявления вирусного генома в ПГЖ даже в малых количествах используют высокочувствительную и специфичную ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). В то же время у этого метода существует ряд недостатков. Так, возможны ложноположительные результаты из-за наличия неспецифических ингибиторов, кроме того, в ПЦР амплифицируется даже разрушенный геном вируса, утратившего инфекционность (7).

Есть сообщения об обнаружении геномного материала ВЯ в эпителиальных клетках глотки с помощью гибридизации in sutu, но при массовом скрининге после экстренной вакцинации этот трудоемкий подход неудобен для практического использования. Установлено, что при ящуре в организме животного образуются антитела как к структурным, так и к неструктурным белкам ВЯ, тогда как инактивированная вакцина индуцирует антитела только к структурным белкам. В связи с этим практическое применение получил серологический метод по определению антител к неструктурным белкам (НБ), или так называемые НБ-тесты. Однако их точность при определении антител в сыворотках крови животных зависит от качества коммерческой вакцины или от наличия НБ, а также от количества антигена в вакцине и от частоты вакцинации (8-11). Следовательно, сохраняется актуальность разработки альтернативных или дополнительных методов обнаружения субклинической инфекции ящура среди вакцинированных животных (12).

По сообщениям зарубежных авторов, существует возможность идентификации животных-вирусоносителей с помощью экспресс-теста на основе иммуноферментного анализа, выявляющего sIgA (так называемый sIgA-ИФА) (3, 4, 12). Ранее мы определили оптимальные условия ИФА для обнаружения вирусоспецифических sIgA в образцах слюны в одном разведении (14).

Целью этой работы стала апробация и сравнительные испытания тест-системы sIgA-ИФА для обнаружения животных-вирусоносителей.

Методика. В эксперименте использовали крупный рогатый скот (КРС) (96 гол., живая масса 200-300 кг, возраст 18-24 мес) из благополучных по ящуру сельскохозяйственных предприятий (Владимирская обл.), в 74

которых не проводилась вакцинация против этой инфекции. Животных иммунизировали подкожно в среднюю треть шеи моновалентной сорбированной противоящурной вакциной (ФГБУ «ВНИИЗЖ», Россия), изготовленной на основе ВЯ типа O (штамм Pan Asia 2), выращенного в клетках ВНК-21 (СТО 00495527-0143-2010), иммуногенность которой, по данным теста на иммуногенность для КРС, составляла, согласно Европейской фармакопеи (15), не менее 6 PD50. Спустя 28 сут после вакцинации КРС заражали штаммом ВЯ О № 2108 Забайкальский/2010 в две точки интра-дермолингвально в дозе 104 ИД50 в 0,2 см3 (контролем служили невакци-нированные зараженные животные) и до 94-х сут (с интервалом 3-4 сут) получали образцы слюны (16), пищеводно-глоточной жидкости (ПГЖ) (17) и сыворотки крови (общепринятым способом). У животных, инфицированных после иммунизации и не проявлявших клинических признаков заболевания, биологический материал отбирали с 18-х сут после заражения в течение 2,5 мес с той же периодичностью. Результаты учитывали на 8-е сут после контрольного заражения. Опыты на животных проводили в экспериментальных условиях на базе вивария Федерального центра охраны здоровья животных.

Постановку ИФА (непрямой «сэндвич»-вариант) осуществляли, как описано (18). Методом одного разведения в ИФА оценивали значение процента позитивности (ПП) (14) (ПП >  40 % считали положительными).

Антитела к неструктурным белкам ВЯ определяли, как описано (19). Для выделения вируса пользовались методикой, утвержденной Департаментом ветеринарии МСХ РФ (10.11.2002). Реакцию микронейтрализации вируса (РМН) выполняли согласно указаниям (6), полимеразную цепную реакцию в реальном времени (ПЦР-РВ) — в соответствии с рекомендациями (20).

Относительную чувствительность, специфичность и точность теста оценивали по формулам, рекомендованным International Epizootic Bureau (IEB — Международное эпизоотическое бюро, МЭБ) (12):

Относительная чувствительность Se = — a + c — х 100 %, [1] Относительная специфичность Sp = — ь d d х 100 %, [2]

где a — истинно положительные; b — ложноположительные образцы; c — ложноотрицательные; d — истинно отрицательные образцы.

При статистической обработке данных были использованы общепринятые методы, рекомендованные И.П. Ашмариным и соавт. (1975), и компьютерная программа MS Excel 2003.

Результаты . При экспериментальном заражении ящуром вакцинированных животных генерализацию заболевания (вторичные афты на конечностях) не отмечали (имелись лишь первичные афты на языке), у не-вакцинированных во всех случаях наблюдались ящурные поражения на конечностях и образование афт на языке.

Всего исследовали 96 образцов слюны от интактного КРС, 40 — от вакцинированных, 5 — от инфицированных спустя 21 сут после вакцинации и 96 — от инфицированных животных. В слюне от интактных и вакцинированных животных до экспериментального заражения противо-ящурные sIgA не выявили. После инфицирования у КРС с клиническими признаками ящура sIgA обнаруживались спустя 5-6 сут, на 8-е сут и на 1011-е сут, что согласуется с результатами других исследователей (6).

В опыте на КРС, предварительно иммунизированном вакциной из штамма ВЯ O Pan Asia 2 с последующим экспериментальным заражением штаммом ВЯ О № 2108 Забайкальский/10, отобрали также пять особей без клинических признаков ящура. Было установлено (данные не опубликованы) близкое антигенное родство штамма ЕЯ О № 2108/Забайкальский/2010 со штаммом O Pan Asia 2 (показатель антигенного родства r 1 = 0,420,47). У этих животных выделение ЕЯ из образцов ПГЖ в чувствительных культурах клеток — первичной (почка поросенка СП) и перевиваемых (почка поросенка IB-RS-2 и почка горного козерога ПСГК-30), а также последующие слепые пассажи положительных результатов не дали. Из пяти обследованных животных у одного (№ 8895) наличие sIgA с помощью sIgA-ИФА выявили в образце слюны на 18-е сут после заражения при ПП = 53,00±0,05 % и в последующие сроки (с 21-х до 94-х сут) — при значениях ПП от 41,00±0,11 до 115,00±0,41 %. Исходя из результатов теста, концентрация sIgA в слюне животного увеличивалась до 67-х сут (ПП = 115,00±0,41 %, OD405 = 1,20±0,14 о.е.), затем незначительно уменьшалась и сохранялась до конца наблюдения (на 94-е сут ПП = 71,00±0,02 %, OD405 = 0,91±0,14 о.е.).

Полученные данные были подтверждены при исследовании образцов слюны в РМН: титр sIgA на 18-е сут равнялся 1,20±0,05 lg, в период с 21-х по 46-е сут составлял до 1,58±0,08-1,90±0,13 lg, дважды достигая максимума (1,90±0,13 lg) (табл. 1), но при этом с 32-х по 53-и сут оказался низкими (1,07±0,09-1,40±0,10 lg) и имел значения, указывающие на отрицательные результаты теста (см. табл. 1). Е завершающий период (после 60-х сут) титр sIgA в целом повышался до 1,50±0,05-1,90±0,13 lg, дважды достигая максимума (см. табл. 1). Анализ результатов определения sIgA в образцах слюны с помощью РМН свидетельствует о существенном колебании значений (как положительные, так и отрицательные), что нежелательно для идентификационного теста.

1. Сравнение динамики накопления антител к вирусу ящура и генома вируса в образцах патологического материала от экспериментально зараженного крупного рогатого скота при исследовании разными методами ( M ± m )

Срок отбора образцов после заражения, сут	Слюна		ПГЖ в ПЦР	Сыворотка крови
	sIgA-ИФА, ПП %	РМН, lg		НБ-ИФА	ИФА, lg	РМН, lg
		Животное № 8895 ( n		= 3)
18	53,00±0,05	1,20±0,05	+	+	2,71±0,15	2,56±0,05
21	54,00±0,19	1,85±0,05	-	+	2,48±0,08	2,70±0,05
28	86,00±0,05	1,58±0,08	+	+	2,56±0,08	2,70±0,15
32	56,00±0,10	1,15±0,25	+	+	2,56±0,05	2,70±0,05
35	41,00±0,11	1,07±0,09	-	+	2,56±0,08	2,70±0,15
39	55,00±0,03	1,90±0,13	+	+	2,40±0,10	2,70±0,05
42	78,00±0,11	1,40±0,10	-	+	1,95±0,08	2,70±0,05
46	65,00±0,10	1,90±0,13	+	+	1,95±0,08	2,56±0,08
49	43,00±0,11	1,20±0,05	-	+	2,26±0,15	2,56±0,05
53	43,00±0,03	1,20±0,05	+	+	1,95±0,08	2,56±0,05
56	н.и.	н.и.	+	+	2,26±0,15	2,56±0,05
60	41,00±0,19	1,58±0,08	+	+	2,26±0,15	2,56±0,05
63	65,00±0,08	1,75±0,13	-	+	2,56±0,05	2,56±0,08
67	115,00±0,41	1,85±0,10	-	+	2,41±0,15	2,56±0,05
74	91,00±0,21	1,60±0,10	-	+	2,33±0,38	2,56±0,05
81	56,00±0,10	1,90±0,13	-	+	2,41±0,15	2,56±0,05
88	88,00±0,51	1,80±0,10	-	+	2,56±0,05	2,70±0,05
91	78,00±0,02	1,90±0,13	-	+	2,70±0,05	2,40±0,10
94	71,00±0,02	1,50±0,05	-	+	2,70±0,05	2,56±0,05
		Животное № 8898 ( n		= 3)
18	8,00±0,03	0,83±0,15	-	+	3,38±0,08	2,70±0,05
21	10,00±0,05	н.и.	+	+	3,23±0,07	2,70±0,15
28	26,00±0,09	1,60±0,05	+	+	3,00±0,05	2,70±0,08
32	64,00±0,10	1,27±0,12	+	+	2,86±0,15	2,70±0,05
35	56,00±0,04	1,60±0,15	+	+	3,00±0,05	2,70±0,05
39	68,00±0,05	1,65±0,10	+	+	2,86±0,15	2,70±0,08
42	47,00±0,11	1,20±0,05	+	+	2,26±0,31	2,70±0,15
46	31,00±0,15	1,50±0,05	+	+	2,56±0,08	2,70±0,08

Продолжение таблицы 1

49	83,00±0,13	1,95±0,15	+	+	2,86±0,15	2,70±0,08
53	70,00±0,16	1,95±0,05	-	+	2,40±0,21	2,70±0,08
56	46,00±0,10	1,80±0,10	-	+	2,86±0,15	2,70±0,15
60	77,00±0,02	1,65±0,15	-	+	2,70±0,05	2,70±0,08
63	73,00±0,16	1,73±0,08	-	+	3,46±0,05	2,70±0,05
67	66,00±0,15	1,50±0,05	-	+	н.и.	2,70±0,08
74	75,00±0,24	1,95±0,15	-	+	2,63±0,37	2,56±0,05
81	68,00±0,15	1,80±0,10	-	+	2,78±0,38	2,56±0,05
88	81,00±0,15	н.и.	-	+	3,46±0,05	2,70±0,15
91	114,00±0,11	н.и.	-	+	3,00±0,05	2,40±0,10
94	89,00±0,13	н.и.	-	+	2,86±0,08	2,40±0,15

Примечание. M — среднее, m — стандартная ошибка среднего; н.и. — не исследовали; «+» и « - » — соответственно положительный и отрицательный результат; ИФА — иммуноферментный анализ, НБ-ИФА — определение антител к неструктурным белкам вируса, ПП — процент позитивности, РМН — реакция микронейтрализации, ПГЖ — пищеводно-глоточная жидкость.

В НБ-ИФА результаты обнаружения антител к неструктурным белкам ВЯ с 18-х по 94-е сут были положительными. В ПЦР РНК ВЯ выявляли в пробах ПГЖ с 28-х по 60-е сут после экспериментального заражения, хотя и не во все сроки. Иными словами, при исследовании слюны sIgA-ИФА давал более однозначные результаты, чем ПЦР. К подобным экспериментальным выводам пришли и другие авторы (5). Согласно полученным данным, это обследованное животное находилось в состоянии ви-русоносительства, что в производственных условиях должно сопровождаться его немедленной изоляцией.

Результаты комплексного исследования образцов биологического материала от другого животного (№ 8898) также наглядно свидетельствовали о скрытой форме инфекции (см. табл. 1). Так, с 32-х сут после экспериментального заражения в слюне с помощью sIgA-ИФА обнаруживали вирусоспецифические sIgA с ПП = 64,00±0,10 %. Во все последующие сроки в sIgA-ИФА получали положительные значения ПП — от 46,00±0,10 до 114,00±0,11 %. В РМН титры противоящурных секреторных антител составляли в основном 1,60±0,10 lg, к 49-м сут достигая 1,95±0,15 lg и сохраняясь до 63-х сут в пределах значений 1,65-1,95 lg. Далее происходило уменьшение титров, что сопровождалось некоторым снижением ПП, но с 74-х сут и до конца наблюдения количество sIgA, выявляемое в слюне как в ИФА, так и в РМН, возрастало (см. табл. 1). В НБ-ИФА постинфекционные антитела обнаружили во всех образцах слюны во все сроки. Кроме того, при исследовании проб ПГЖ в ПЦР реакция была положительной на 21-49-е сут после экспериментального заражения. Следует отметить, что у всех инфицированных животных в сыворотке крови определяли высокий уровень вируснейтрализующих антител независимо от формы развития инфекции (персистентная или типичная), причем в течение всего периода наблюдений существенных различий не установили. Это обстоятельство еще раз продемонстрировало, что выявление вируснейтрализующих антител в сыворотке крови не подходит для идентификации животных-вирусоносителей.

У животного № 8896 sIgA были выявлены в ИФА на 74-94-е сут после инфицирования, в РМН — на 81-94-е сут (титр 1,80-1,95 lg). Тем не менее, результаты ПЦР-анализа на наличие РНК ВЯ для образцов ПГЖ, отобранные в период с 21-х по 94-е сут, оказались отрицательными. Можно предположить, что содержание животных совместно с вирусоносителями в одном боксе в течение 2 мес послужило причиной повторного контактного инфицирования.

При исследовании двух других животных (№ 8897 и № 8899) по описанной схеме их не идентифицировали как вирусоносителей. На основании анализа образцов слюны и ПГЖ у животного № 8897 не представ- ляется возможным сделать вывод о вирусоносительстве, так как sIgA не были обнаружены ни в sIgA-ИФА, ни в РМН, а в ПЦР РНК ВЯ выявлялась только с 18-х по 32-е сут (вероятно, вследствие экспериментального заражения). У особи № 8899 в слюне с помощью sIgA-ИФА секреторные иммуноглобулины были выявлены только на 21-е сут, но результаты исследования образцов слюны в РМН не подтвердили наличия вирусоспецифических sIgA (титр < 0,9-1,2±0,005 lg). При этом в ПГЖ с 18-х по 32-е сут, а также на 46-е и 49-е сут с помощью ПЦР детектировали РНК ВЯ.

Таким образом, на основании полученных данных нами было сделано заключение об идентификации двух животных (№ 8895 и № 8898), инфицированных после вакцинации, как вирусоносителей.

Для оценки результатов исследований и в связи с отсутствием их подтверждения референтным методом выделения ВЯ из проб ПГЖ в культуре клеток данные, полученные с применением тест-системы sIgA-ИФА ФГБУ «ВНИИЗЖ», сравнили с итогами референтного теста, выполненного Satya Parida (World Reference Laboratory for Foot-and-Mouth Disease — WRLFMD, Pirbright Institute, Great Britain) по валидированной методике (6) с теми же образцами слюны. Специфичность валидированного sIgA-ИФА составляла 97,1 % при пороговом значении OD405 = 0,47; с увеличением порогового значения до 0,60 показатель специфичности теста повышался до 99,4 % (6). При сравнении чувствительности и специфичности разработанной нами тест-системы относительно тест-системы WRLFMD образцы, не проверенные одним из методов, исключали, сомнительные идентифицировали как положительные. По результатам исследования 91 образца слюны чувствительность разработанной тест-системы относительно референтной (WRLFMD) составила 100 %, относительная специфичность — 97,7 %, точность — 99,0 %.

Кроме того, на основании сравнения результатов исследования образцов слюны, полученных с помощью тест-систем sIgA-ИФА ФГБУ «ВНИИЗЖ» и WRLFMD (табл. 2), определили к -критерий ( к -статистика), характеризующий согласованность результатов для двух тест-систем.

2. Согласованность результатов применения иммуноферментных тест-систем World Reference Laboratory for Foot-and-Mouth Disease (WRLFMD) и ФГБУ «ВНИИЗЖ» для выявления противоящурных sIgA в образцах слюны крупного рогатого скота

WRLFMD Ф11Л «ВНИИЗЖ»	Положительный	Отрицательный	Всего	Выявленная превалентность
Положительный             а = 47                   b = 1            а + b = 48 ( а + b )/n = 48/91 = 0,53 Отрицательный              с = 0                    d = 43           с + d = 43 ( c + d)/n = 43/91 = 0,47 Всего                     а + c = 47               b + d = 44 Выявленная        ( а + c )/ n = 47/91 = 0,52 ( b + d )/ n = 44/91 = 0,48                n = 91 превалентность Примечание. a — истинно положительные; b — ложноположительные образцы; c — ложноотрицательные; d — истинно отрицательные образцы; n — размер выборки.

Показатель абсолютной согласованности результатов sIgA-ИФА ( a + d )/ n составил (47 + 43)/91 = 0,99; случайной согласованности положительных результатов — 0,52 х 0,53 = 0,28; случайной согласованности отрицательных результатов — 0,48 х 0,47 = 0,23; обобщенной случайной вероятности согласованности результатов — 0,28 х 0,23 = 0,06; наблюдаемой согласованности результатов без учета случайностей — 0,99 - 0,06 = 0,93; неслучайной максимально возможной согласованности методов — 1 - 0,06 = 0,94; к -критерий ( к -статистика) — 0,93/0,94 = 0,99. Это значение к -критерия свидетельствует об очень хорошей согласованности результатов применения двух тест-систем.

Èòàê, òåñò-ñèñòåìà íà îñíîâå íåïðÿìîãî «ñýíäâè÷»-âàðèàíòà ÈÔÀ, ïðåäëîæåííàÿ íàìè äëÿ îïðåäåëåíèÿ IgÀ ê âèðóñó ÿùóðà â îáðàçöàõ ñëþíû êðóïíîãî ðîãàòîãî ñêîòà, ïîçâîëÿåò èäåíòèôèöèðîâàòü æèâîòíûõ-âèðóñî-íîñèòåëåé. Îïðåäåëåíû äèàãíîñòè÷åñêèå õàðàêòåðèñòèêè ïðåäëàãàåìîãî òåñ-òà, â òîì ÷èñëå îòíîñèòåëüíî âàëèäèðîâàííîãî ìåòîäà. Ïîëó÷åííûå äàííûå ñâèäåòåëüñòâóþò î òîì, ÷òî ðåçóëüòàòû òåñòèðîâàíèÿ ñ èñïîëüçîâàíèåì óêà-çàííûõ ñèñòåì (ðàçðàáîòàííîé â Ôåäåðàëüíîì öåíòðå îõðàíû çäîðîâüÿ æèâîò-íûõ â Ðîññèè è â World Reference Laboratory for Foot-and-Mouth Disease â Âå-ëèêîáðèòàíèè) ñîãëàñóþòñÿ äîñòàòî÷íî õîðîøî ( κ -êðèòåðèé = 0,99).

ФБГУ Федеральный центр охраны здоровья животных, Поступила в редакцию 600901 Россия, г. Вёадимир, мкр. Юрьевец, фгбу «впиизж».          31 марта 2014 года

DIAGNOSTIC VALUE OF A TEST FOR DETECTION OF SECRETORY IgA FOR CONFIRMATION OF ABSENCE OF FMD VIRUS CIRCULATION

D.N. Afonina, N.Ye. Kamalova, A.V. Kan’hina, A.M. Timina