О ДРИМ-генотипировании возбудителей бактериозов картофеля, их антагонистов и бактерий-деструкторовдлярешения задач защиты растений и экологии

Сохранение окружающей среды при интенсификации сельскохозяйственного и промышленного производства связывают с развитием экотехнологий, в том числе с биоконтролем патогенов растений и биоремедиацией. Микроорганизмы - продуценты биопрепаратов и деструкторы углеводородов характеризуются высокой спонтанной вариабельностью, что может приводить к изменению их активности, поэтому при стабилизирующем отборе необходимо периодически подтверждать их штаммовую принадлежность. Молекулярно-генетические методы исследований дают возможность идентифицировать возбудителей заболеваний c полной характеристикой их наследственного материала. В этой работе представлены данные о применении разработанного нами метода двойного расщепления и избирательного мечения (ДРИМ) для изучения генетических профилей бактерий-фитопатогенов родов Pseudomonas , Pectobacterium и их антагонистов Bacillus subtilis ( Bs ), подтверждена высокая биологическая эффективность двух отселектированных штаммов Bs (М-22 и И5-12/23) против бактериальных болезней картофеля при хранении клубней в производственных условиях. Также впервые выполнена генетическая идентификация (паспортизация) штаммов бактерий-деструкторов рода Pseudomonas , пригодных для решения природоохранных задач. Цель исследований заключалась в оценке генетического разнообразия бактерий нескольких родов для отбора наиболее эффективных штаммов-антагонистов и штаммов-деструкторов. Примененный нами метод генотипирования основан на использовании двух эндонуклеаз рестрикции для расщепления геномной ДНК бактерии. Присутствующая в реакционной смеси ДНК-полимераза (Taq) обеспечивает мечение фрагментов ДНК биотинилированным дезоксицитозинтрифосфатом (Bio-dCTP). Метка включается только в ДНК, имеющую 3¢-усеченные концы, которые образует первый ферментом. Вторая эндонуклеаза рестрикции дает только тупые концы фрагментов, которые не способны присоединять метку. В результате переноса на фильтр визуализируются 20-50 четко различимых фрагментов ДНК, число и распределение которых характерно для каждого бактериального штамма. Генотипирование двух близкородственных штаммов Pectobacterium atrosepticum позволяет распознать около 50 фрагментов ДНК, более 20 % которых специфичны для одного из сравниваемых штаммов. Мы использовали две пары эндонуклеаз рестрикции - XbaI/DraI и XbaI/Eco24I; полученные результаты указывают на одинаковую дискриминационную способность ферментов при сопоставлении штаммов P. atrosepticum Д822 и Г784 по генетическим профилям. При генотипировании бактерий рода Pseudomonas оптимальной была пара BcuI/Eco32I, для Bs первая рестриктаза - SgsI (39 сайтов расщепления), вторая (уменьшает размер получаемых фрагментов ДНК) - Eco32I. Методом ДРИМ получены генетические профили микроорганизмов родов Pectobacterium и Pseudomonas , характеризующие индивидуальность каждого штамма. Отмечены существенные генетические различия между видами Ps. fluorescens и Ps. marginalis . При этом выявлены идентичные фрагменты ДНК, что указывает на родовую филогенетическую близость этих видов. При искусственном заражении клубней установлена высокая антагонистическая активность Bs И5-12/23 в отношении штаммов P. atrosepticum и P. сarotovorum subsp. catovorum. Подтверждена высокая биологическая эффективность двух отселектированных штаммов Bs (М-22 и И5-12/23) против бактериальных болезней картофеля при хранении клубней. Штамм Bs И5-12/23 обладал более выраженной антагонистической активностью против возбудителей мягкой бактериальной и кольцевой гнилей, а также фузариоза. При хранении обработка штаммами-антагонистами снижала пораженность почти вдвое по сравнению с контролем (30,4-35,5 % здоровых клубней против 13,3 %). По результатам генотипирования биодеструкторов рода Pseudomonas сформирована коллекция штаммов, утилизирующих трудноокисляемые соединения, включая тяжелые фракции нефти и полиароматические углеводороды (бензопирен, хризен, фенантрен, антрацен, хризен, нафталин), что позволяет составлять ассоциации штаммов-деструкторов для утилизации конкретных загрязнителей. Таким образом, ДРИМ-генотипирование позволяет идентифицировать бактериальные штаммы для подтверждения их происхождения при разработке и применении биопрепаратов различного назначения.