О генoтоксичности модифицированных нуклеозидов

• ¹    Самарский государственный университет

• ²    Самарский муниципальный университет Наяновой

Анализировали генотоксичность синтезированных модифицированных аналогов нуклеозидов: 1- в -D-рибофуранозилбензотриазол(I), 1- в -В-рибофуранозилбензоимидазол(П), 1- в -D-эритрофурано-зилбензоимидазол (III). Обнаружили, что все синтезированные соединения индуцируют рецессивные и доминантные летальные мутации у Drosophila melanogaster, ингибируют бласттрансформа-цию ядер лимфоцитов периферической крови человека и понижают фертильность самок и самцов Drosophila melanogaster. Обсуждается возможность влияния синтезированных соединений на клеточное деление.

В медицине широко используются модифицированные нуклеозиды как антибактериальные и антивирусные препараты [3,8]. Между тем давно известно, что многие из них проявляют генотоксичность так как представляют собой модифицированные предшественники ДНК. Так 4,6-ами-ноурацил индуцирует хромосомные аберрации у Vicia faba; 8-азагуанин и 8-азатимин являются сильными метастатиками для животных клеток; 5-бромурацил - специфический мутаген для прокариот [9]. Аналоги пурина - кофеин, ксантин, ксантозин индуцируют гетероплоидию [7].

Высокая потребность в новых фармакологических препаратах побуждает синтезировать новые модифицированные нуклеозиды, которые необходимо подвергнуть генетическому мониторингу.

Были синтезированы аналоги нуклеозидов: 1- P -D-рибофуранозилбензотриазол (I), 1 - P -D-рибофуранозилбензоимидазол

(II), 1- P -D-эритрофуранозилбензоимидазол (III), структурные формулы которых приведены на рисунке 1.

Мы предположили, что структурное сходство синтезированных соединений (I,II, III) с природными пуринами послужит причиной появления у них генотоксичных свойств.

Мутагенную активность определяли по способности веществ индуцировать рецессивные и доминантные летальные мутации у дрозофилы [2,4], а также индуцировать хромосомные аберрации в лимфоцитах периферической крови человека [5]. Токсичность веществ определяли по ингибированию бла-сттрансформации лимфоцитов периферической крови человека, стимулированные к клеточному делению ФГА, а также по способности веществ снижать фертильность Drosophila melanogaster.

При анализе мутагенной активности I -III использовали в дозеLD50, которая была

• (I)                                        (II)                                 (III)

Рис.1. Структурные формулы синтезированных веществ

Таблица 1. Способность веществ индуцировать доминантные летали у имаго Drosophila melanogaster

Вещество Процент доминантных леталей у самок Процент доминантных леталей у самцов I 11,04 ± 1,03 9,59 ± 1,02 II 9,20 ± 1,83 8,80 ± 1,08 III 8,94 ± 0,46 9,41 ± 0,46 контроль 3,12 ± 0,67 3,04 ± 0,46 предварительно определена и для имаго Drosophila melanogaster составила для I и II -1/ 4 от насыщенного водного раствора, для III-1/2 от насыщенного водного раствора. Время воздействия мутагенами - 30 часов.

Для анализа способности I - III индуцировать доминантные летали растворами синтезированных соединений воздействовали либо на самок (900 штук), либо на самцов (900 штук), которых затем скрещивали с интактными особями противоположного пола. Число доминантных летальных мутаций (ДЛМ) оценивали по количеству яиц из которых не вылуплялись личинки. Кладки яиц собирались в течение суток каждые 5 часов.

Результаты эксперимента суммированы в таблице 1.

Статистический анализ с использованием критериев Стьюдента и Фишера показал, что все синтезированные соединения достоверно (для P>99%) индуцируют доминантные летали в опыте по сравнению с контролем. Мы не обнаружили достоверных отличий в действии веществ на самок и самцов, кроме того все веществ индуцировали приблизительно одинаковое количество доминантных летальных мутаций.

Способность I - III вызывать рецессивные летальные мутации в Х-хромосомах самцов Drosophila melanogaster определяли стан дартными методом "Меллер-5". Результатом исследования представлены в таблице 2.

Проведенный статистический анализ не выявил отличий между действием веществ, но показал что все вещества достоверно индуцируют рецессивные летальные мутации у самцов Drosophila melanogaster для P>99%.

Анализ способности веществ индуцировать хромосомные аберрации в лимфоцитах периферической крови человека, показал что в концентрации, не вызывающей гемолиз эритроцитов - 0,001%, соединения не проявляют мутагенный эффект. Было проанализировано 200 препаратов. Ни в одной из проанализированных нами мета-фазных пластинок мы не обнаружили хромосомных перестроек.

Отсутствие мутагенного ответа на уровне клеточной культуры не говорит о специфичности действия данных веществ, так как на уровне целого организма многие вещества, не проявившие мутагенную активность, проходят дополнительную активацию и становятся мутагенами. Ферментативные системы Drosophila melanogaster обладают такими свойствами, и поэтому рекомендованы для генетического мониторинга. Кроме того, они обладают ферментативной активностью, сходной с таковой у микросомальной фракции ферментов печени млекопитающих, где и про-

Таблица 2. Способность аналогов нуклеозидов индуцировать рецессивные летали в Х-хромосомах самцов Drosophila melanogaster

Вещества	Число проанализированных хромосом	Процент рецессивных леталей
I	1200	3,06 ± 0,99
II	1009	2,85 ± 0,39
III	1100	2,87 ± 0,36
контроль	1150	0,16 ± 0,28

Таблица 3. Способность модифицированных нуклеозидов подавлять бласттрансформацию ядер лимфоцитов периферической крови человека

Вещества Число бласттрансформированных ядер лимфоцитов (в %) в культурах, обработанных соединениями в концентрациях 0% 0,001% 0,0001% I 94,80 ± 1,90 83,00 ± 1,10 87,40 ± 1,22 II 95,11 ± 1,89 73,80 ± 1,50 81,80 ± 1,50 III 94,78 ± 1,90 80,91 ± 1,34 85,20 ± 1,41 исходит метаболическая активация веществ, и, следовательно, синтезированные нами соединения могут проявить мутагенную активность и в тестах на млекопитающих.

При анализе числа бласттрансформиро-ванных ядер мы обнаружили цитостатический эффект действия исследуемых аналогов нуклеозидов (табл.3). Результаты анализа цитотоксичности представлены в таблице 3.

Все вещества ингибируют бласттрансформацию ядер (различия между опытом и контролем достоверны для P>99%). Разведение в 10 раз не снижает цитотоксического эффекта, кроме того соединения проявляют равное ингибирующее действие.

Так как полученные нами результаты говорят о наличии у I - III генотоксических свойств, то мы предположили, что могут ингибировать и фертильность у тест-объек-та. Для этого 1600 самок и самцов, подвергнутых воздействию токсикантов, скрещивали с интактными особями противоположно-

Изменение количества отложенных яиц при воздействии токсикантами на имаго дрозофилы

2- 1- в -D-рибофуранозилбензоимидазол,

3- 1— в -D-зритрофуранозилбензоимидазол, 4-контроль

Рис.1. Результаты анализа влияния веществ на фертильность дрозофилы го пола. Каждые 5 часов подсчитывали число отложенных яиц. Мы обнаружили, что у самок и самцов Drosophila melanogaster снижается количество отложенных яиц (рис.1).

Статистический анализ показал, что вещества достоверно снижают фертильность Drosophila melanogaster, причем если I равнотоксичен как для самок, так и для самцов, у которых в равной степени падала фертильность, то II сильнее подавлял фертильность у самцов, а III - у самок (P>95%). Снижение фертильности по нашему мнению является косвенным показателем эмбриотоксичности исследуемых веществ.

Проведенное исследование показало, что все изученные аналоги нуклеозидов обнаружили генотоксичность и это позволяет предположить, что причиной генотоксичности служит нарушение процессов клеточного деления. В пользу этого предположения говорят данные полученные другими авторами [1, 6], показавшими, что аналоги предшественников ДНК нарушают нормальную репликацию и таким образом подавляют или изменяют отдельные стадии клеточного деления.