О перспективности нанопрепаратов на основе сплавов микроэлементов-антагонистов (на примере Fe и Co)

В процессе метаболизма химических элементов в организме человека и животных происходит их взаимодействие с другими элементами (1, 2), аминокислотами (3), ферментами (4) и т.д. Целесообразность изучения таких взаимодействий определяется необходимостью донозологической диагностики и лечения элементозов, коррекции диет (5), оценки истинной питательности рационов (6, 7). При этом исторически особое внимание уделялось нормированию небольшой группы микроэлементов (железо, цинк, медь и др.), усвоение которых подвержено влиянию антагони-

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект ¹ 14-36-00023). Гематологические исследования проводились по стандартизированным методикам в лаборатории «Агроэкология техногенных наноматериалов» и Испытательном центре ФГБНУ Всероссийского НИИ мясного скотоводства (аттестат аккредитации RA. RU.21ПФ59 от 02.12.15). Анализ образцов ткани экспериментальных животных на содержание химических элементов выполнен в лаборатории АНО «Центр биотической медицины», г. Москва (аттестат аккредитации ГСЭН.RU.ЦАО.311, Регистрационный номер в Государственном реестре РОСС RU. 0001.513118).

стов (8). Появились методы нивелирования негативного влияния некоторых веществ на усвояемость микроэлементов, в частности основанные на раздельном включении в рацион веществ-антагонистов (9). Подобный прием препаратов цинка и железа положительно влияет на рост и развитие детей в первый год жизни (10). На принципе раздельного использования микроэлементов-антагонистов основаны схемы применения ряда витаминно-минеральных комплексов (ВМК). Наиболее известный российский представитель этой линейки препаратов — ВМК «Алфавит». Подтверждению его эффективности посвящен ряд исследований, демонстрирующих факты повышения биологической доступности микроэлементов, в том числе цинка, железа и др. (11).

Представляется, что с началом производств наноматериалов можно достичь аналогичный результат через использование наночастиц металлов. Для веществ этого класса с размерами частиц около 100 нм показана низкая токсичность (12). Сообщается, что препараты наночастиц металлов (в частности, железа) значительно превосходят соответствующие минеральные соли по биодоступности (13, 14). Целесообразность применения микроэлементов в наноразмерной форме в составе рационов для животных и птицы продемонстрирована в ряде работ (15-18).

Свойства наночастиц (в том числе высокая проникающая способность) позволили нам предположить перспективность альтернативного решения — объединения микроэлементов-антагонистов в один препарат, представляющий собой ультрадисперсные нанопорошки их сплавов.

В представляемой работе мы впервые сравнили рост, гематологические и биохимические показатели у цыплят-бройлеров отечественного кросса при скармливании индивидуальных солей двух микроэлементов либо их сплава в наноразмерной форме. Выбор пары антагонистов (железо и кобальт) определялся одинаковым механизмом их абсорбции в кишечнике (19, 20). Согласно нашей гипотезе, следует ожидать, что препарат наночастиц сплава Fe и Co будет выгодно отличаться от их минеральных солей по биодоступности этих элементов in vivo и продуктивному действию.

Целью эксперимента стала апробация подхода по оптимизации минерального питания цыплят-бройлеров на основе введения в рацион наночастиц сплава двух микроэлементов-антагонистов.

Методика . Наночастицы сплава железа и кобальта получали методом высокотемпературной конденсации (установка Миген-3, Институт энергетических проблем химической физики РАН, г. Москва) в соответствии с описанной ранее методикой (21). Материаловедческая аттестация препаратов включала электронную сканирующую и просвечивающую микроскопию на JSM 7401F и JEM-2000FX («JEOL», Япония). Рентгенофазовый анализ выполняли на дифрактометре ДРОН-7 (НПО «Буревестник», Россия). По итогам аттестации размер частиц был равен 62,5±0,6 нм с соотношением Fe и Co 7:3. С целью получения лиозолей для последующего скармливания птице водные взвеси наночастиц обрабатывали 30 мин ультразвуком на диспергаторе УЗДН-2Т («НПП Академприбор», Россия) (35 кГц, 300/450 Вт, 10 мкА).

Исследования проводили на цыплятах-бройлерах кросса Смена 7 в условиях вивария (Оренбургский государственный университет). Содержание птицы и процедуры при выполнении экспериментов соответствовали требованиям инструкций и рекомендациям, предусмотренным национальным регламентом (Приказ МЗ СССР ¹ 755 от 12.08.1977) и «The Guide for Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Washington, 554

D.C., 1996)». Были предприняты все усилия, чтобы свести к минимуму страдания животных и уменьшить число используемых образцов.

Для эксперимента отобрали 100 курочек в возрасте 1 сут. Птицу, получившую индивидуальный номер (ножные пластиковые бирки), взвешивали и далее содержали в одинаковых условиях. В 2-недельном возрасте на основании данных индивидуального ежесуточного взвешивания и учета затрат корма методом пар-аналогов сформировали три группы (одну контрольную и две опытные) по 30 особей в каждой.

Использованные полнорационные комбикорма были составлены с учетом рекомендаций (22). Основной рацион (ОР) птицы включал следующие ингредиенты: в возрасте 14-28 сут — зерно пшеницы (320 г/кг) и ячменя (10 г/кг), жмых подсолнечный (184 г/кг), шрот соевый (200 г/кг), рыбная мука (40 г/кг), масло растительное (60 г/кг), зерно кукурузы (163 г/кг), отруби пшеничные (10 г/кг), известняк (10 г/кг), соль поваренная (3 г/кг); в возрасте 29-42 сут — зерно пшеницы (182 г/кг) и ячменя (50 г/кг), жмых подсолнечный (180 г/кг), шрот соевый (75 г/кг), рыбная мука (45 г/кг), масло растительное (45 г/кг), зерно кукурузы (400 г/кг), отруби пшеничные (10 г/кг), известняк (10 г/кг), соль поваренная (3 г/кг). Содержание витаминов и минеральный солей нормировали с помощью премиксов П5 и П6 (соответственно для птицы в возрасте до 28 сут и старше) (ООО «Коудайс МКорма», Россия), включающих витамины A, D, E, K₃, B₁, B₂, B₃, B₄, B₅, B 6 , B₁₂, B_c и H; микроэлементы Fe, Mn, Cu, Zn, I, Se и Co (c нормой ввода в рацион 2 %).

Цыплята из контрольной группы на протяжении всего эксперимента получали ОР, остальной птице в период с 14-х по 42-е сут в рацион дополнительно вводили препараты железа (7 мг/кг корма) и кобальта (3 мг/кг корма) с солями FeSO4•7H2O и CoCl2 (I группа) или наночастицы сплава железа и кобальта (II группа) в суммарном количестве, идентичном таковому в I группе. Для поения цыплят во всех группах использовали дистиллированную воду.

Кровь для анализа брали у 42-суточных бройлеров перед убоем утром натощак из подкрыльцовой вены в вакуумные пробирки (для морфологического исследования — c EDTA в качестве антикоагулянта, для оценки биохимических показателей — с активатором свертывания тромбином). Исследования сыворотки крови проводились не позднее 3 ч после взятия проб. При убое учитывали массу и отбирали образцы тканей и органов для оценки элементного состава (образцы сразу же подвергали замораживанию и хранили при - 18 ° С).

Морфологические показатели определяли с помощью автоматического гематологического анализатора (модель URIT-2900 Vet Plus, «URIT Medial Electronic Co., Ltd», Китай). Биохимическое исследование сыворотки крови проводили на автоматическом анализаторе СS-T240 («DIRUI Industrial Co., Ltd», Китай) с использованием коммерческих наборов для ветеринарии (ДиаВетТест, ЗАО «ДИАКОН-ДС», Россия; «Randox Laboratories Ltd», Великобритания). Аминокислотный состав тканей печени определялся методом капиллярного электрофореза с использованием системы Капель (ООО «Люмэкс-Маркетинг», Россия) после пробоподготовки, включающей высушивание при температуре не выше 50 ° С, обезжиривание петролейным эфиром и измельчение до прохождения через сито с размерами стороны квадратной ячейки 0,5 мм.

Химический состав биоматериала и кормов после озоления исследовали методами атомно-эмиссионной спектрометрии (Optima 2000 V, «Per- kin Elmer», США) и масс-спектрометрии (Elan 9000, «Perkin Elmer», США) согласно рекомендациям производителя. Озоление биосубстратов проводили с использованием микроволновой системы разложения Multiwave-3000 («Anton Paar», Австрия).

Рассчитывали совокупный пул химических элементов в организме. За условный показатель биодоступности химического элемента из корма принимали вычисленное отношение прироста пула вещества в организме к величине его поступления с кормом за период опыта.

Статистическую обработку полученных данных проводили c использованием программного пакета Statistica 10.0 («StatSoft Inc.», США) и Microsoft Excel. Результаты представлены в виде среднего ( M ) и стандартной ошибки среднего ( m ). Достоверность различий сравниваемых показателей определяли по t -критерию Стьюдента. Достоверными считали значения при р ≤ 0,05.

Результаты . В качестве подтверждения рабочей гипотезы о большей биодоступности железа и кобальта из наночастиц их сплава в сравнении с минеральными солями мы рассматриваем факт превышения пула железа в организме цыплят из II опытной группы к окончанию эксперимента на 72,4 % (р ≤ 0,001) относительно контроля и на 21,6 % (р ≤ 0,01) — по сравнению с показателями в I группе (рис. 1, А). Аналогичная разница по кобальту составила соответственно 59,5 % (р ≤ 0,001) и 24, 8 % (р ≤ 0,05). Разница по содержанию железа и кобальта в печени и мышцах колебалась в пределах от 20 % до 140 % (см. рис. 1, Б).

Рис. 1. Пул Fe и Со в организме 42-суточных цыплят-бройлеров кросса Смена 7 (А) и разница в накоплении этих элементов в тканях относительно контроля (без добавок) (Б) при включении в рацион солей Fe и Co (I группа бройлеров, n = 15) или наночастиц сплава Fe и Co (II группа бройлеров, n = 15): а — Fe (мг), б — Co (мкг); в — I группа, г — II группа (описание групп см. в разделе «Методика»; эксперимент в условиях вивария).

*, ** Различия с контролем достоверны соответственно при р ≤ 0,05 и р ≤ 0,01.

Оценка совокупного поступления химических элементов с кормом и увеличение их общего пула позволила рассчитать удельную долю, отложенную в организме цыплят за период опыта. Установлено, что при использовании наночастиц увеличение ретенции железа из корма достигало 50,0 %, кобальта — 34,7 %. Это согласуется с результатами M.F. Aslam с соавт. (23), полученными при использовании препаратов наночастиц железа, и закономерно связано с особенностями клеточного поглощения нано- и растворимых форм металлов (23). Известно, что железо в кишечнике способно всасываться посредством эндоцитоза в составе сложных комплексов, например ферритина растительного происхождения. Ферритин может содержать несколько тысяч атомов железа (24, 25). Транспорт наночастиц металлов происходит в том числе за счет эндоцитоза (23). Это явление хорошо описано в литературе. Интенсивность высвобождения металлов из наноформ ниже в сравнении с ионными формами, что дает ос-556

нование рассматривать наночастицы металлов как выгодную альтернативу минеральным солям (например, в качестве источника микроэлементов). Относительно медленное высвобождение железа из наноформ и сохранение содержания этого элемента в крови обеспечивает отсутствие гомеостатического давления на обмен железа как причины окислительного стресса. Это может быть преимуществом при значительном поступлении железа в пищеварительный тракт, что наблюдается после абсорбции терапевтических доз растворимого железа (26, 27). Определенную роль играет и более низкая способность энтероцитов удерживать металлы в виде наночастиц по сравнению с ионной формой (28).

Нет оснований полагать, что регуляция обмена Fe, высвободившегося после деградации наночастиц Fe+Co и из состава FeSO4, будет происходить по различным механизмам. Исходя из этого, увеличение общего пула железа в организме при использовании препарата наночастиц надо рассматривать как следствие относительно медленного высвобождения этого элемента из наноформы.

Выявленный факт увеличения пула железа во II группе не был сопряжен с достоверным ростом концентрации железа в сыворотке крови по сравнению с показателями в I группе (табл. 1). Возможно, это связано с гомеостатическими реакциями, направленными на регуляцию количества железа в биологических жидкостях (известно, что избыток железа может привести к генерации активных форм кислорода) (29). В то же время скармливание контрольным цыплятам дефицитного по железу рациона сопровождалось достоверным снижением концентрации этого металла в сыворотке крови относительно таковой в I и II группах — соответственно на 78,3 % (р < 0,01) и 74,3 % (р < 0,01).

Незначительные изменения в содержании гемоглобина в крови птицы из I и II групп согласуются с результатами исследований на мышах линии Swiss (CD1) (30), в которых показано, что препарат нано-Fe (III) по способности эффективно восстанавливать количество гемоглобина очень похож на сульфат железа.

1. Морфологические и биохимические показатели крови 42-суточных цыплят-бройлеров кросса Смена 7 при включении в рацион солей Fe и Co (I группа) или наночастиц сплава Fe и Co (II группа) ( M ± m , n = 15, эксперимент в условиях вивария)

Показатель	Контроль (без добавок)	I группа	II группа
Железо, ммоль/л	15,2±0,40	27,1±0,25*	26,5±0,75*
Гемоглобин, г/л	95,6±1,01	98,0±1,63	101,0±1,01*
Эритроциты, 1012/л	2,1±0,13	2,6±0,13	2,6±0,12
Лейкоциты, 109/л	16,3±1,76	19,5±1,13	21,0±1,09*
Глюкоза, ммоль/л	6,3±0,27	6,4±0,23	8,6±0,15*
Холестерин, ммоль/л	3,6±0,05	4,4±0,27	4,3±0,37
Мочевина, ммоль/л	1,3±0,02	1,8±0,06*	1,5±0,10
Общий белок, г/л	33,3±1,20	33,0±2,51	37,3±1,28*
Щелочная фосфатаза, нмоль•с - 1•л - 1	343,6±24,86	336,6±17,39	423,3±16,36
Креатинин, мкмоль/л	31,3±1,66	51,3±1,49*	43,3±1,73*
Билирубин, мкмоль/л	3,5±0,27	3,6±0,02	1,1±0,05
* Различия с контролем достоверны при р ≤ 0,05.

Нами установлен факт увеличения содержания креатинина в сыворотке крови на 63,9 % (р ≤ 0,01) в I и на 38,3% (р ≤ 0,05) — во II группе. При этом у цыплят в I группе концентрация мочевины была выше на 38,5 % (р ≤ 0,05), а во II группе количество глюкозы превышало контроль на 36,5 % (р ≤ 0,05).

2. Рост цыплят-бройлеров кросса Смена 7 и кормозатраты при включении в рацион солей Fe и Co (I группа) или наночастиц сплава Fe и Co (II группа) ( M ± m , n = 15, эксперимент в условиях вивария)

Группа	Живая масса				Затраты корма на 1 кг прироста
	всего, г		прирост за опыт (14-42-е сут)
	14-е сут	42-е сут	кг	к контролю, %	кг	к контролю, %
Контроль I	262,3±7,5 267,7±9,1	1523,3±10,4 1606,7±19,7	1,26±0,08 1,34±0,11	106	2,48 2,25	90,7
II	266,7±12,7	1661,3±10,9*	1,40±0,09	111	2,14	86,3
Прим еч ани е. Прирост и затраты корма в контроле приняты за 100 %

* Различия с контролем достоверны при р ≤ 0,05.

Включение в рацион железа и кобальта сопровождалось увеличением интенсивности роста цыплят. В частности, за период опыта прирост живой массы в I группе превысил контрольные показатели на 6 % (р ≤ 0,05), во II — на 11 % (р ≤ 0,001). При этом затраты корма в контрольной группе были выше соответственно на 9,3 и 13,7 %. Более того, по сравнению с эффектом солей указанных микроэлементов использование их сплава в форме наночастиц повышало прирост живой массы на 4,1 % (р ≤ 0,05) при снижении расхода корма на 4,8 % (табл. 2).

Использование препарата наночастиц сопровождалось увеличением массовой доли аргинина в печени цыплят из II группы до 8,1±0,105 % по сравнению с контрольным значением (5,05±0,075 %) (рис. 2).

Рис. 2. Разница в величине массовых долей (РМД) аминокислот в печени 42-суточных цыплят-бройлеров кросса Смена 7 при включении в рацион солей Fe и Co (а, I группа, n = 15) или наночастиц сплава Fe и Co (б, II группа, n = 15) (эксперимент в условиях вивария) .

* Различия с контролем достоверны при р ≤ 0,05.

Это в целом согласуется с ранее полученными нами данными (31, 32) по оценке биологического действия частиц железа и меди на организм цыплят-бройлеров. Установлено, что поступление наночастиц и микрочастиц (d = 10-40 мкм) сопровождалось накоплением аргинина в печени. Известно, что обмен аргинина тесно связан с развитием воспалительного и окислительного стресса (33, 34). Кроме того, аргинин — один из факторов, регулирующих рост молодых животных (35-37). Ростостимулирующие эффекты L-аргинина связаны с изменением баланса потребляемой и расходуемой энергии в пользу сжигания жира или снижением роста белой жировой ткани. L-аргинин активирует митохондриальный биогенез и развитие бурой жировой ткани (38). У цыплят-бройлеров кросса Cobb 500 A.M. Fouad с соавт. (39) показали снижение массы брюшной жировой ткани и количества циркулирующих липидов под влиянием добавок диетического L-аргинина.

В нашем опыте на фоне применения наночастиц сплава Fe и Co не наблюдалось критических значений по накоплению конечных продуктов метаболизма белков, в частности мочевины. В то же время в I группе прослеживалась тенденция к увеличению этих показателей при достоверном различии с контролем на фоне приема солей Fe и Co (38,46 %, р < 0,05).

Результаты анализа азотсодержащих соединений указывали на интенсификацию белкового обмена при поступлении кобальта в разных формах. Возможно, присутствие кобальта в составе наночастиц стало до-558

полнительным фактором активизации белкового обмена. Ранее об аналогичных результатах сообщали Л.Г. Каширина с соавт. (40).

Использование препаративной формы наночастиц (в отличие от солей) сопровождалось увеличением содержания белка в сыворотке крови на 12,0 % (р ≤ 0,05) относительно контроля. При этом интенсивность роста цыплят из II группы оказалась достоверно выше. Содержание белка в сыворотке крови в I группе не отличалось от контрольного.

Важным фактором интенсификации стало повышение переваримости корма. В частности, во II группе переваримость протеина корма увеличилась на 3,1 % (р ≤ 0,01), углеводов — на 2,3 % (р ≤ 0,05). Соответствующие различия между контролем и I группой оказались статистически недостоверными.

Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют в пользу предлагаемого подхода по оптимизации минерального питания сельскохозяйственной птицы на основе использования сплавов микроэлементов-антагонистов в наноразмерной препаративной форме. Известно, что соли металлов в жидкой среде быстро диссоциируют, гидратируются и становятся физиологически недоступными. Кроме того, несвязанное железо — индуктор перекисного окисления липидов и перекисной деструкции белков. Металлы в наночастицах, если они высвобождаются постепенно, будут иметь лучшую усвояемость, а их токсическое воздействие окажется сведенным к минимуму. Возможно, этим обусловлен наблюдаемый положительный эффект увеличения живой массы и некоторый рост содержания гемоглобина у птицы, получавшей нанопрепарат. Выявленные экспериментальные факты, по нашему мнению, указывают на более высокую доступность и продуктивное действие препарата наночастиц сплава Fe и Co в сравнении с минеральными солями этих элементов.