О распространении вируса лейкоза птиц в птицеводческих хозяйствах на территории России

У кур экзогенные ВЛП приводят к развитию лимфоидного и миелоидного лейкоза, эритробластоза, миелобластоза, миелоцитоматоза, опухолей соединительной и эндотелиальной ткани, остеопетроза, менингиом и глиом. Формы новообразований, индуцируемые ВЛП, зависят от штамма вируса, дозы и способа заражения, генотипа, пола и возраста восприимчивого организма (2). Из этих видов опухолей наиболее распространен лимфоидный лейкоз (ЛЛ), или В-клеточная лимфома, первично образующаяся в фабрициевой сумке и инициирующая метастазы в висцеральных органах (2, 3). От кур, пораженных лимфоидным лейкозом, в большинстве случаев выделяют вирус подгруппы А (2). Представители подгруппы J (описаны сначала в Англии в 1989 году, а позже и в других странах) первично были обнаружены у кур мясных пород при массовом заболевании миелоидным лейкозом (МЛ) (4-7).

Экзогенные ВЛП передаются как вертикально, так и горизонтально (при условии полной инфекционности вируса), эндогенные — обычно через зародышевые клетки обоих полов (8). Среди эндогенных многие генетически дефектны и не могут обеспечить развитие инфекционных вирионов. Однако некоторые все же способны экспрессироваться в эмбрионах или у вылупившихся птенцов с образованием инфекционной формы (3).

Несмотря на применяемые методы контроля за этой инфекцией, она широко распространена во всем мире и наносит значительный ущерб промышленному птицеводству. В основном экономические потери обусловлены уменьшением продуктивности (отбраковка бройлеров при забое, уменьшение яйценоскости и снижение качества яиц) и высокой смертностью птицы, которая составляет примерно 1-2 %, но в некоторых случаях достигает 20 % и более (9). Исследования эпизоотологической ситуации по лейкозу птиц в России пока что немногочисленны (10).

Мы изучили распространение вируса лейкоза птиц в птицеводческих хозяйствах на территории Российской Федерации и охарактеризовали молекулярно-генетические свойства полученных изолятов.

Методика . Обследование проводили в 2005-2011 годах в 223 птицеводческих хозяйствах (86 — яичного, 107 — бройлерного и 21 — племенного направления) из 46 регионов России. Обследовали птицу следующих линий: Hysex white, Hysex brown, Lohmann white, Lohmann brown, Lohmann LSL, Lohmann NIC, Shaver white, Shaver brown, Rodonit (яичное направление) и Ross 308, Cobb, Hubbard F 15 (ISA) (бройлерное направление). Всего на наличие ВЛП и антител к ВЛП подгруппы J проанализировали более 10 000 образцов сыворотки крови, полученной от клинически здоровых кур. Сыворотку крови при транспортировке помещали на лед и в дальнейшем содержали при - 20 ° С до проведения исследований. Пробы, используемые для тестирования методом ИФА, хранили в фосфатном буферном растворе (pH 7,0) с 0,1 % Tween 80, предназначенные для анализа методом ПЦР — в замороженном состоянии без добавления реагентов.

Для обнаружения вирусов в пробах и подтверждения их наличия в выделенных препаратах применяли коммерческий набор ИФА-АВИВАК-ВЛП для выявления группоспецифического антигена ВЛП р27 (ООО НПП «АВИВАК», Россия) по методике производителя. Содержание антител против ВЛП подгруппы J определяли с помощью набора Avian leucosis virus subgroup J antibody test kit для иммуноферментного анализа («Sinbiot-ics», Франция) в соответствии с прилагаемой инструкцией.

При выделении вирусов в качестве вируссодержащего материала в основном использовали лейкоцитарную фракцию крови (отбирали образцы крови птицы с клиническими признаками неопластических заболеваний, положительные по группоспецифическому р27-антигену ВЛП при ИФА-тестировании) и клоакальные смывы от инфицированных особей. Первичную культуру фибробластов, полученных от 11-суточных SPF (specific pathogen free — свободных от возбудителей инфекционных болезней) куриных эмбрионов («Lohmann Tierzucht», Германия), инокулировали ви-руссодержащим материалом и помещали в СО₂-инкубатор на 10-14 сут при температуре 37 ° С (контроль — неинокулированные куриные фибробласты), через 10-14 сут полученную культуральную жидкость и суспензию клеток анализировали на наличие ВЛП методами ИФА и ПЦР. Каждый ВЛП + -изолят проверяли на наличие вируса болезни Марека (серотипы 1, 2 и 3), вируса ретикулоэндотелиоза, а также на бактериальную контаминацию с использованием моноклональных и поликлональных антител (ADOL — USDA-ARS Avian disease and Oncology Laboratory, США).

Выявление генома ВЛП и дифференциацию вирусов проводили с применением коммерческого ПЦР-набора Тест-система для детекции и дифференциации ВЛП («ВетБиоХим», Россия) согласно рекомендациям производителя. ПЦР-фрагменты разделяли при помощи гель-электрофореза и очищали, используя набор для выделения из геля Geneclean kit («Qbiogene Inc.», Канада). Первичную структуру полученных ДНК-фрагментов определяли на автоматическом ДНК-секвенаторе ABI 377 («Applied Biosystem»,

США) и анализировали с использованием компьютерных программ Mac-Vector/AssemblyLign (Oxford Molecular Group, США) и PHYLIP (University of Washington, США).

Результаты . Согласно принятому в настоящее время территориально-административному делению, в Российской Федерации имеется 83 региона, включая области, республики, края, автономные области и автономные края (в отдельные регионы выделены города Москва и Санкт-Петербург, которые при мониторинге не учитывали). Мы изучали эпизоотологическую ситуацию в отношении лейкоза птицы в 46 регионах (табл. 1).

1. Наличие («+») или отсутствие (« - ») р27-антигена вируса лейкоза птиц (ВЛП) и антител к ВЛП подгруппы J в обследованных промышленных птицеводческих хозяйствах разного направления (по регионам России и годам наблюдения)

Регион	Год	Число хозяйств
		всего	по направлениям
			мясное		яичное		племенное
			+	—	+	1 —	+     1     -
Амурская область	2005-2006	2	2 (J)
Астраханская область	2007	2			2 (p27)
Республика
Башкортостан	2006-2008	4			1 (p27)		2 (p27); 1 (J)
Белгородская область	2005-2009	13	6 (J)	3 (p27); 1 (J) 2 (J)			2 (J)
Брянская область	2007	1	1 (Р27)
Владимирская область	2005-2007,
	2011	9	2 (Р27); 1 (J)		4 (p27)		2 (p27)
Волгоградская область	2005-2008	7	1 (p27); 5 (J) 1 (р27); 2 (J) 1 (p27)
Вологодская область	2005-2008	6	1 (p27); 1 (J) 1 (p27); 1 (J) 2 (p27)
Воронежская область	2006	1	1 (p27)
Ивановская область	2006, 2008	2	1 (p27)		1 (p27)
Калининградская
область	2005	1				1 (p27)
Калужская область	2008	1	1 (J)
Кировская область	2005-2008	4	1 (J)	1 (J)	1 (p27)		1 (p27)
Респубика Коми	2005	1			1 (p27)
Костромская область	2005-2006	2	1 (J)			1 (J)
Краснодарский край	2005-2006,
	2010	12	3 (p27); 6 (J)		1 (p27)		3 (p27); 5 (J)
Красноярский край	2006-2007	3	1 (p27)		2 (p27)
Курганская область	2005-2007	3	2 (p27); 1 (J)
Курская область	2005-2009	5	1 (p27); 2 (J)		3 (p27); 2 (J)
Липецкая область	2006-2007,
	2010	5	5 (p27); 2 (J) 1 (J)
Республика Марий Эл	2005	1			1 (p27); 1 (J)
Республика Мордовия	2006, 2010	2			1 (p27)	1 (p27)
Московская область	2005-2008,	6	2 (J)		3 (p27)		1 (p27); 1 (J)
	2010
Нижегородская	2005-2007,
область	2011	18			12 (p27); 4 (J)1 (J)		1 (p27); 1 (J)1 (J)
Новгородская область	2005-2008	5	1 (J)		4 (p27)	1 (J)
Новосибирская область 2006		1		1 (J)
Омская область	2005-2006,	3	1 (p27); 1(J)	1 (J)
	2008
Оренбургская область	2007-2008	2	2 (J)
Орловская область	2005-2008	5	2 (p27); 4 (J) 1 (p27); 1 (J)
Пермская область	2005-2009	9	4 (J)		4 (p27)	2 (J)
Пензская область	2007	1	1 (p27)
Псковская область	2006	1			1 (p27)
Ростовская область	2005-2006,	8
	2008		3 (p27); 4 (J)		3 (p27); 1 (J)
Рязанская область	2005-2007,
	2009	6	1 (J)		1 (p27)		4 (p27); 2 (J)
Самарская область	2005-2009	9	5 (p27); 7 (J)
Саратовская область	2005-2007	9		2 (J)	2 (p27)		2 (p27); 5 (J)1 (p27); 1 (J)
Свердловская область	2005-2008	5	1 (J)				4 (p27); 1 (J)
Ставропольский край	2006-2009	7	2 (p27); 1 (J)		4 (p27)
Тамбовская область	2007	1	1 (J)
Республика Татарстан	2005-2007	4	1 (J)	1 (J)	2 (p27)
Тверская область	2005-2007	4	1 (p27); 3 (J)

Продолжение таблицы 1

Тульская область	2005, 2007-2009	8	1 (p27); 2(J) 1 (p27)	4 (p27); 1 (J)
Тюменская область	2008	1	1 (J)
Удмуртская Республика 2005-2006		3		2 (p27)       1 (p27)
Челябинская область	2005-2009	8	2 (J)	2 (p27); 2 (J)	2 (p27); 2 (J)
Чувашская Республика	2006-2007	2	2 (J)
Ярославская область	2005-2008, 2010	10	1 (J)	5 (p27); 1 (J)	4 (J)
Всего	2005-2011	223

В промышленных птицехозяйствах примерно в 50 % регионов России провели мониторинг антител к ВЛП, в 37 % — исследовали наличие вирусов ВЛП. В 58 % регионов при этом использовали ИФА, в 42 % — ПЦР. Из обследованных хозяйств 50 % составили бройлерные, 40 % — яичные и 10 % — племенные (по птице как бройлерного, так и яичного направления).

Широкий анализ банка сывороток, собранных за период с 2005 по 2011 год, подтвердил, что практически на всех обследованных птицефабриках яичного направления (97 %) и более чем в 50 % бройлерных хозяйств поголовье инфицировано ВЛП. Антитела против ВЛП подгруппы J выявили в образцах сывороток, собранных на 70 % обследованных птицефабрик как яичного, так и бройлерного направления. В сыворотках, полученных из 8 хозяйств (9 % от обследованных), антитела против ВЛП-J не обнаружили. Отметим, что здесь отбор образцов проводился однократно и серопозитивные особи, возможно, будут выявлены в дальнейшем, поскольку в 11 хозяйствах (13 %) специфические антитела детектировали только при повторных исследованиях.

Для анализа соотношения инфицированной и сероположительной по ВЛП птицы в зависимости от возраста и направления использования собранные сыворотки ранжировали по семи возрастным группам для яичных и бройлерных хозяйств. Увеличение доли положительных по ВЛП образцов (рис. 1, А) наблюдали до возраста 101-130 сут, далее этот показатель постепенно уменьшался. Наибольший рост числа образцов, в которых детектировали ВЛП, в птицеводческих хозяйствах яичного направления отмечали в одной возрастной группе (101-130 сут, до 67 %), бройлерного — в двух группах (41-100 сут, 68 %; 101-130 сут, 66 %).

Рис. 1. Доля образцов, позитивных по вирусу лейкоза птиц (ВЛП) (А) и содержащих антитела к ВЛП подгруппы J (Б) , от общего числа образцов сыворотки крови, взятых в обследованных промышленных птицеводческих хозяйствах из 46 регионов России, в зависимости от возраста птицы и направления ее использования: а — яичное направление, б — бройлеры (20052011 годы).

Количество антител против ВЛП-J (см. рис. 1, Б) у птицы из хозяйств яичного направления повышалось до 130-суточного возраста, после чего доля серопозитивных особей резко снижалась (до 7 %) и затем дости-

2. Изоляты вируса лейкоза птиц , выделенные при обследовании промышленных птицеводческих хозяйств в 46 регионах России

Обозначение, №	Место и время обнаружения
132	Липецкая область, июнь 2010 года
346	Московская область, январь 2010 года
138	Ростовская область, сентябрь 2010 года
130	Свердловская область, январь 2010 года
76	Ростовская область, март 2010 года
11	Владимирская область, июнь 2011 года
9	Владимирская область, июнь 2011 года
7	Владимирская область, июнь 2011 года
5	Владимирская область, июнь 2011 года
2	Владимирская область, июнь 2011 года
3	Владимирская область, июнь 2011 года
8	Нижегородская область, март 2011 года

гала максимального значения (46 %) в старшей возрастной группе (более 300 сут). В бройлерных хозяйствах титр антител с возрастом птицы постоянно увеличивался. Наибольший процент сероположительных по ВЛП-J образцов для обоих типов птицеводческих хозяйств отмечали в старшей возрастной группе (более 300 сут): для яичного и бройлерного направления значения составили соответственно 46 и 49 % (см. рис. 1).

Наличие ВЛП подтипа J

было подтверждено в хозяйствах племенного яичного направления (линии Hysex, Rodonit, Ross 308) и получены полевые изоляты вируса.

№76

№132

№138

- EF467236SDO5O1 AY013303

г № 8

L DQ500007

" AY013304

№ 346

Leicos Vladimir AD

M37980 RSA NC001408 RSA EU070900 PDRC-1039

№130

AY350569

АВ 112960

АВ303223

YJ_Vladimir

EU264064 SD07LK1

EU264065 SD07LK2 FJ216405 SD07LK1 DQ115805 NX0101 Z46390HPRS103 MJ Vladimir

Рис. 2. Дендрограмма, характеризующая генетические различия между изолятами вируса лейкоза птиц (ВЛП) разного происхождения (построена на основании первичной структуры фрагмента кДНК гена env ВЛП) : №№ 2, 3, 5, 7, 8, 9, 11, 76, 130, 132, 138, 346 — выделены при обследовании промышленных птицеводческих хозяйств в 46 регионах России; изоляты MJ_Vladimir и YJ_Vladimir выделены во Всероссийском НИИ здоровья животных (г. Покров, Московская обл.) и предоставлены для сравнительного нуклеотидного анализа.

AY158693

Кроме того, всего нам удалось выделить 12 полевых изолятов ВЛП (табл. 2) (11). У них был амплифицирован вирус-специфический вариабельный фрагмент кДНК гена env .

Результаты анализа нуклеотидных последовательностей полученных ампликонов и их сравнения с последовательностями, описанными для зарубежных штаммов ВЛП, отражает дендрограмма, характеризующая генетические различия (рис. 2). Нуклеотидные последовательности выделенных ранее зарубежных штаммов ВЛП получали из банка данных GenBank .

Изоляты №№ 8, 76, 130, 132, 138 и 346 образовали одну филогенетическую группу с известными ранее изолятами (AY013303, EF467236, DQ500007, AY013304, EU070900, EU070901, EU070902, M37980, NC_001408, DQ365814, AY350569, AB303223, AB112960) при внутригрупповых различиях, не превышающих 5 %. В этой группе представлены эндогенные и экзогенные рекобинантные ВЛП, которые выделены на территории США, Китая, Франции и Японии, начиная с 1993 года. Изоляты №№ 2, 3, 5, 7, 9, 11, 138 и 346 образуют вторую филогенетическую группу с изолятами ВЛП подгруппы J, полученными на территории Китая, Франции и США (внутригрупповые различия превышают 10 %). В целом исследуемые изоляты сформировали две обширные группы, в каждую из которых входят выделенные нами образцы.

Итак, в 90 % обследованных нами птицеводческих хозяйств были выявлены антитела к вирусу лейкоза птиц (ВЛП), в 70 % хозяйств как яичного, так и бройлерного направления — антитела к ВЛП подгруппы J. Процент инфицирования поголовья в птицеводческих хозяйствах этих направлений увеличивается с возрастом поголовья при максимуме в возрасте 101-130 и более 300 сут. С использованием первичной культуры куриных фибробластов выделены 12 изолятов ВЛП, которые идентифицированы методами ИФА и ПЦР. В результате филогенетического анализа полученных изолятов установлено, что они незначительно отличаются от описанных на территории других стран, что может указывать на наличие общего предшественника.