Об участии холестерола, прогестерона, кортизола и липопротеинов в возрастных изменениях обмена веществ у цыплят-бройлеров промышленного кросса

Еще И.И. Шмальгаузен отмечал, что морфофизиологические изменения напрямую связаны с действием факторов внешней среды на совокупность процессов развития (1). Ответ организма на внешнее воздействие становится своего рода раздражителем, обусловливающим последующие реакции, но специфика формообразовательных реакций зависит прежде всего от самого организма, его нормы реакции и этапа онтогенеза, на котором действуют раздражители (1).

Гомеостаз, который объединяет циклы синтеза и распада химических веществ в жизнеспособную морфофункциональную структуру открытой системы — организма (2), можно определить как поддержание относительного динамического постоянства внутренней среды на основе взаимосвязанных системных регуляторных и метаболических процессов с участием факторов эндогенной и экзогенной природы, определяющих онтогенетическое развитие (3, 4). У бройлерных цыплят на ранний неонатальный период развития приходятся критические стадии, когда формируются физиолого-биохимические механизмы, обеспечивающие впоследствии ус- тойчивое функционирование и адаптационные возможности организма в условиях промышленных технологий (3, 5-7). Основой гомеостаза, сформированной в процессе эволюционного развития вида, и первичным связующим звеном между эндо- и экзогенными энергетическими и пластическими потоками, сигнальными воздействиями служит эндокринная регуляция. Она включает иерархическую цепь гормонов, содержание которых в крови по типу обратной связи определяет, в том числе, количество холестерина и липопротеинов крови, отражающее как процессы синтеза гормонов надпочечников, так и их регуляторные эффекты (2, 8-10). Один из таких гормонов — прогестерон, синтезируемый из холестерина липопротеинов низкой плотности, наиболее известен участием в эндокринном контроле формирования, роста и развития плода. К основным циркулирующим метаболитам прогестерона и ведущим предшественникам стероидов относится 17-гидроксипрогестерон (11, 12). Недавно установлено что прогестерон и его синтетические производные оказывают прямое (за счет нейростероидов группы прегненолона, синтезируемых de novo из холестерола в головном мозге птиц) (12) и опосредованное (13, 14) воздействие на вегетативный и центральный отделы нервной системы, включены в нейромедиаторный контроль хронологических ритмов постнатального роста и развития за счет рецепторного взаимодействия с γ-аминомасляной кислотой (12, 13) и дофамином, влияют на органогенез сосудов, опорно-двигательного аппарата (15), скелетной мускулатуры, имеющей гипертрофированное развитие у цыплят-бройлеров (5, 9), миелинизацию нервных волокон (13). Собственно прогестерон, 17-гидроксипрогестерон и его метаболит кортизол — одни из первичных активаторов и эффекторов гипоталамо-гипофизарно-адреналовой оси (10, 16). Тем не менее, информация о роли прогестерона и его производных в липидном и белковом метаболизме (несмотря на прямую связь биосинтеза этих метаболитов, в частности липопротеинов низкой и высокой плотности, и гормонов) крайне ограничена. Имеющиеся сведения в основном получены в медицине, тогда как в отношении сельскохозяйственных животных, где подобные исследования имеют важное практическое значение, данные единичны, разрознены или почти отсутствуют.

Мы впервые провели системное исследование содержания липопротеинов высокой и низкой плотности (непосредственно вовлечены в обмен белков и липидов), общего холестерола, прогестерона, 17-гидроксипрогес-терона, кортизола в плазме крови у цыплят кросса Hubbard F15 в возрасте 1, 7, 23 и 42 сут в связи с параметрами роста и развития и проанализировали эти биохимические показатели методами корреляционного анализа и главных компонент (факторный анализ). Выявлены возрастные закономерности изменений в концентрации этих метаболических и регуляторных факторов, что может отражать смену их роли в процессе роста и адаптации.

Целью работы было изучение динамики содержания ряда метаболитов и гормонов (липопротеинов, холестерина, прогестерона и его производных) в плазме крови бройлеров с учетом изменения массы тела для оценки возрастных изменений этих факторов и их роли в онтогенезе.

Методика. Эксперименты выполняли на бройлерах кросса Hubbard F 15 (ООО «Чебаркульская птица», Челябинская обл.), из которых в цехе выращивания (клеточное содержание) по принципу сбалансированности сформировали группы P1, P7, P23, P42 (в каждой n = 10; возраст птицы по группам — 1, 7, 23 и 42 сут). Кормление и содержание осуществляли согласно зоогигиеническим нормам без ограничений в доступе к корму (17).

Кровь для исследования получали при декапитации птицы в 1- и 7-суточном возрасте с соблюдением принципов гуманности, изложенных в 750

директивах Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) и Хельсинкской декларации, и прижизненно пункцией подкрыльцовой вены вакуумным методом у 23- и 42-суточных цыплят. В плазме, стабилизированной EDTA, определяли общий холестерол (TCS), липопротеины низкой плотности (LDL), липопротеины высокой плотности (HDL) — ферментативным методом с помощью коммерческих наборов Вектор-Бест (Россия) и Ольвекс Диагностикум (Россия) (18, 19); гормоны — методом твердофазного имму-ноферментного анализа (ИФА) с тест-системами сэндвич-типа («XEMA Co., Ltd», Россия) Прогестерон-ИФА К207 для прогестерона (Pregn-4-ene-3,20-dione, P4) (20), 17-ОН-Прогестерон-ИФА К217 для 17-гидроксипро-гестерона (17-OHP) и Кортизол-ИФА К210 для кортизола (Cortisol) (11). При анализе на гормоны образцы инкубировали в термостатируемом шейкере ELMI Sky Line Shaker ST-3 («ELMI, Ltd», Латвия), оптическую плотность измеряли на фотометре для иммуноферментных тест-систем MINDRAY MR-96A Elisa Microplate Reader («MINDRAY Ltd», КНР).

Определяли среднесуточный прирост массы тела за возрастные периоды: А_ссп = (W₁ - W₀)/(Т₁ - Т₀), где W₀ и W₁ — масса тела в начале и конце учетного периода (г) в возрасте Т₀ и последующем возрасте Т₁ (сут).

Для идентификации структуры взаимосвязей анализируемых элементов выполняли корреляционный анализ по Пирсону (Pearson Correlation, r-Pearson) и факторный анализ (Factor Analysis) (21) нормально распределенных в исследуемой выборке значений биохимических параметров (STA-TISTICA 8.0, «StatSoft, Inc.», США). Факторы выделяли методом главных компонент (Principal Сomponents, для вращения факторов применяли метод Varimax) (21). Цифровые данные представлены средней арифметической ( X ) и стандартной ошибкой средней (±SEM). Степень и достоверность различий для полученных результатов оценивали с помощью параметрического t -критерия Стьюдента в программе STATISTICA 8.0. Различия считали статистически значимыми при р ≤ 0,05.

Результаты. К 7-м сут кривые изменения концентрации TCS и ли-

1. Динамика биохимических показателей крови и массы тела у бройлерных цыплят кросса Hubbard F15 в раннем постнатальном онтогенезе ( X ±SEM, n = 10, ООО «Чебаркульская птица», Челябинская обл., 2014 год)

Показатель Возраст, сут 1-е :      7-е 23-и       । 42-е Липопротеины высокой плотности, ммоль/л 1,79±0,04 1,17±0,03*** 1,36±0,05*** 1,69±0,04 Липопротеины низкой плотности, ммоль/л 5,68±0,27 1,39±0,28*** 1,81±0,16*** 2,32±0,13*** Общий холестерол, ммоль/л 8,67±0,57 3,14±0,25*** 4,65±0,32*** 4,84±0,14*** Прогестерон, нмоль/л 63,00±3,59 65,28±2,20 57,13±2,40 51,07±4,28 17-Гидроксипрогестерон, нмоль/л 10,76±1,61 19,43±3,40* 17,87±3,36* 8,30±1,42 Кортизол, нмоль/л 2274,31±59,47 2341,42±44,29 2351,38±35,37 2256,00±45,18 Среднесуточный прирост массы, г/сут                  16,37±0,21      49,98±0,11***   79,28±1,05*** *, **, *** Различия с показателем в возрасте 1 сут статистически значимы по t-критерию соответственно при p < 0,05; p < 0,01; p < 0,001. попротеинов были параллельны кривым снижения содержания HDL до 34,64 % (p < 0,001), LDL — до 75,53 % (p < 0,001) и холестерола — до 63,78 % (p < 0,001) (табл. 1). С 23-х сут наблюдалась постепенное возрастание и стабилизация количества общего стерина и липопротеинов. Однако наибольшее приближение к показателю в группе 1-суточных цыплят по содержание HDL отмечали в возрасте 42 сут (см. табл. 1). Изменение содержания прогестерона и кортизола оказалось недостоверным, в то же время кривые абсолютного количества кортизола и его прекурсора — прогестерона (Cortisol и P4) были обратно симметричны кривым для HDL, LDL и TCS при относительно повышенных значениях с 7-х по 23-и сут

(см. табл. 1). Динамика концентрации 17-OHP и приростов массы тела у бройлерных цыплят имела достоверное сходство с пиком максимальных значений в возрасте 7-23 сут, а среднесуточный прирост массы тела оказался наибольшим на 23-и сут — 305,32 % (p < 0,001) (см. табл. 1). Кроме HDL, к 42-м сут содержание 17-OHP восстанавливалось до такового в возрасте 1 сут, а абсолютное значение суточного прироста живой массы за период с 23-х по 42-е сут было наиболее высоким, хотя оставалось ниже референтного, которое зарегистрировали с 7-х по 23-и сут (305,32 %, p < 0,001), составляя только 158,62 % (p < 0,001) (см. табл. 1).

Мы рассчитали взаимные корреляции (в том числе с учетом корреляций по Пирсону) и определили факторы и соответствующие главные компоненты среди изученных биохимических показателей в разные периоды роста и развития бройлеров (табл. 2).

• 2 . Результаты факторного анализа биохимических показателей крови у бройлерных цыплят кросса Hubbard F15 в раннем постнатальном онтогенезе с использованием метода главных компонент

Показатель	Возраст, сут
	1	7		23	42
	фактор
	1	1	2	1           2	1	2

Липопротеины:

высокой плотности 0,80* 0,07 0,66 0,91* 0,07 -0,40 0,74* низкой плотности 0,83* 0,40 0,73* 0,68 0,29 0,97* -0,03 Общий холестерол -0,88* -0,17 0,73* -0,53 0,06 0,89* -0,24 Прогестерон -0,88* 0,91* -0,17 -0,26 -0,88* 0,20 0,76* 17-Гидроксипрогестерон -0,60 0,62 0,25 0,74* -0,55 0,66 0,39 Кортизол -0,74* 0,88* 0,31 0,34 -0,77* -0,11 0,84* Прим еч ани е. Вращение факторов методом Varimex. Для каждого идентифицированного фактора рассчитаны главные компоненты и приведены их корреляции. * Корреляции, статистически значимые при p < 0,05.

Схема, отражающая вовлеченность холестеро-ла, прогестерона, кортизола и липопротеинов в процессы роста и развития у цыплят-бройлеров кросса Hubbard F15: LDL — липопротеины низкой плотности, MDL — липопротеины промежуточной плотности, HDL — липопротеины высокой плотности; А, Б и В — синтез соответственно половых гормонов, кортизола и 17-гидроксипрогестерона; Г, Д и Е — конверсия липопротеинов низкой плотности и протеинов в липопротеины высокой плотности; 1 и 1.1 — регуляция обеспечения процессов роста и развития организма пластическими веществами, 2 — взаимная регуляция процессов адаптации, роста и развития, 3 — регуляция обмена LDL, 4 — регуляция метаболизма 17-гидрок-сипрогестерона и половых гормонов, 5 — регуляция превращения 17-гидроксипрогес-терона, 6 — регуляция синтеза HDL. Процессы биосинтеза обозначены сплошными линиями, регуляции — пунктирными.

Методом главных компонент у бройлерных кур в возрасте 1 сут мы выявили один общий фактор, за периоды с 7-х по 23-и и с 23-х по 42-е сут жизни — по два фактора (см. табл. 2). На основании полученных результатов и данных литературы нами предложена обобщенная схема взаимодействия изученных гормонов и метаболитов (рис.). На схеме процессы, в которые вовлечены эти компоненты, разделены на синтетические и регуляторные, а их эффекты проявляются последовательно: на текущей стадии развития формируется физиолого-биохимическая платформа (процессы, обозначенные нами как приспособительные; физиологические эффекты I), обеспечивающая рост и развитие на следующем этапе (физиологические эффекты II). В соответствии с данными таблицы 2 и схемой, факторы, которые выделились для каждого из изученных периодов, включали главные компоненты, отнесенные нами в основном либо к приспособительным, либо к ростовым, или совокупный фактор, объединяющий компоненты с приспособительной и ростовой функцией (см. табл. 2, рис.). Так, у цыплят в возрасте 1 сут выявлен интегративный фактор обменных и приспособительных процессов, включающий гормональные и метаболические компоненты (см. табл. 2). Это характеризует их существенную взаимосвязь (r-Pearson: P4и Cortisol — r = 0,69, p = 0,027; P4и TCS — r = 0,82, p = 0,004; HDL и LDL — r = 0,83, p = 0,003; HDL и TCS — r = -0,67, p = 0,033) в самый ранний постнатальный период, когда обмен веществ еще полноценно не сформировался (3, 5, 6, 9), и отражает напряженность всех функциональных систем при переходе от пренатальной к постнатальной стадии и воздействии факторов окружающей среды (22), что определяет гомеостатические параметры, обеспечивавшие образование de novo пластических и энергетических ресурсов для последующего роста и развития (3, 9, 23) (см. табл. 2, рис.). На 7-е сут у бройлерной птицы установлен фактор (см. табл. 2, рис.), включающий прогестерон и кортизол как главные компоненты (r-Pearson: P4 и Cortisol — r = 0,73, p = 0,016), и фактор донорства холестерола посредством активной конверсии холестерина LDL на синтез прогестерона и соответственно эндокринной цепи 17-OHP с его продуктами — половыми гормонами, кортизолом и другими стероидами (15, 16) (см. табл. 1, 2, рис.). Прогестерон (наряду с соматотропном и тиреоидными гормонами) обеспечивает прирост массы тела, прежде всего за счет регуляции синтеза белков, в основном протеинов скелетной мускулатуры и тканей внутренних органов (24). Прогестерон оказывает влияние на основной обмен у кур, повышает интенсивность метаболизма. Кортизол непосредственно участвует в комплексных приспособительных реакциях как на молекулярном, мембранном, клеточном, тканевом, органном уровнях (10, 16), так и системно, усиливает или ослабляет (в зависимости от цены адаптации в соответствии с периодом онтогенеза) адаптивные реакции, взаимно регулируя метаболизм 17-OHP (25) (см. рис.). Известно что эстрогены и другие гормональные продукты 17-гидроксипрогестерона в норме способствуют утилизации LDL и усилению синтеза HDL, вовлечены в обеспечение пластическими элементами (24, 26-28) (см. рис.).

В возрасте 23 сут у цыплят выявили два фактора — один включал HDL и 17-OHP, другой — прогестерон и кортизол (см. табл. 2), что согласуется с данными S. Rettenbacher с соавт. (29). Они показали, что повышение содержания глюкокортикоидов вследствие стресса или экзогенного экспериментального воздействия (например, введения интактным курам) может приводить к снижению превращения прогестерона в 17-OHP и его производные из-за ингибирования специфических ферментов (в том числе 17-α-гидроксилазы, 17,20-лиазы, 17p-гидроксистероиддегидрогеназы) или конкурентного взаимодействия глюкокортикоидов с ядерными и мембранными рецепторами прогестерона, участвующими в регуляции образования синтезирующих его ферментов (29). В то же время в условиях in vitro без экзогенного стрессирования глюкокортикоиды не препятствуют превращению прогестерона в инкубируемых тканях яичника курочек и тестикул петушков в 17-OHP и далее в андростендион, тестостерон и другие стероидные продукты (29). Показано (30), что стрессы ингибируют фермент, ответственный за конверсию холестерола в прегненолон. При этом, как отмечалось и нами (см. табл. 1), прогестерон, как и кортизол, имел стабильную динамику со статистически недостоверным различием содержания с 7-х по 42-е сут, а пики по 17-OHP и приросту массы, наоборот, достоверно пришлись на период с 7-х по 23-и сут (см. табл. 1). Достижение баланса интенсивных приспособительных и ростовых реакций основывается на высоких ресурсных затратах и в наибольшей степени может проявляться в начале формирования функциональных систем (3, 22, 31). Так, у цыплят яичного кросса отмечен наибольший рост массы тела во II и III декадах (8), что согласуется с нашими данными (см. табл. 1). Выявленное в возрасте 42 сут донорство холестерина (см. табл. 2) (r-Pearson: LDL и TCS — r = 0,86, p = 0,002), видимо, обеспечивает эндокринный пул синтеза прогестерона и его производных (15, 16, 25) (см. табл. 1, 2, рис.). Сообщалось (8), что у цыплят кросса белый леггорн рост стабилизируется после 30-х сут жизни. В нашем исследовании стабилизацию и консолидацию приспособительных и ростовых процессов в IV и начале V декады отражали главные компоненты, выявленные в возрасте 42 сут (см. табл. 2).

Эти сложные взаимодействия обеспечиваются через рецепторы гормонов оси прогестерона (14, 28), в том числе глюкокортикоидов. Происходит модуляция метаболизма липопротеинов и реализация их физиологических эффектов (28) (см. рис.), в частности сосудистых. В события вовлекаются внутриклеточные ядерные рецепторы (14) и так называемых внеге-номные интегральные мембранные рецепторы прогестерона (14, 15), участвующие в экспресс-ответах, не сопровождающихся генной транскрипцией (14, 15), и, видимо, необходимые в процессах роста и развития.

Таким образом, в совокупности полученные данные свидетельствуют, что при росте и развитии цыплят изменяется скорость использования холестерина для биосинтеза стероидных гормонов, что отражается на концентрации липопротеинов и гормонов в крови, а также их взаимосвязи. Возраст цыплят и, соответственно, характер физиологических процессов в их организме, в том числе опосредуемых прогестероном, 17-гид-роксипрогестероном и кортизолом, определяет формирование гомеостаза, обеспечивающего развитие устойчивости к физиологическим последствиям промышленных стрессов. Продолжением исследований может быть оценка роли этих гормонов и метаболитов в определении пределов реакции, приспособительных возможностей бройлеров, цены адаптации к факторам интенсивного воспроизводства в связи с границами нормы и патологии.