Обоснование компонентного состава комплексного средства «Цеапитокс» в отношении Т-2 токсина в опытах in vitro

Из-за изменения климата, области здравоохранения, сельского хозяйства и экономики, ежегодно сталкиваются с проблемой контаминации кормов животных микотоксинами [7, 12, 15]. При таких неустойчивых погодных и температурных условиях на любом этапе заготовки и хранения зерновых кормов возможен рост микроскопических грибов рода Fusarium, Aspergillus и иных, выделяющих вторичные метаболиты жизнедеятельности – микотоксины [10, 14]. Токсическое действие, оказываемое ими, проявляется в ослаблении иммунитета, нарушении работы печени, почек и многом другом. Патологические процессы, возникающие после поступления микотоксинов в организм животных и птицы, при несвоевременной профилактике и запоздалом лечении, иногда могут приводить к летальному исходу. Проходя через организм, микотоксины транспортируются в органы и ткани животных, и затем – в продукцию животноводства, что представляет серьезную угрозу здоровью человека [11].

Согласно многолетнему микотоксикологическому мониторингу, 40100 % мировых запасов, а также 70 % кормов Российской Федерации загрязнены микотоксинами [1, 5, 8]. Одним из самых опасных и часто встречающихся микотоксинов является Т-2 токсин, который продуцируют трихотеценовые грибы Fusarium Sporotrichioides и F.paoe [3]. Холодные климатические зоны с повышенной влажностью благоприятны для произрастания данных микроскопических грибов (влажность выше 14 %, температура 6-24 °C) [11]. Т-2 токсин влияет в первую очередь на иммунокомпетентные и кроветворные органы, а также на репродуктивные функции, естественную резистентность, показатели крови и жизнедеятельности живых организмов в общем.

Проведение комплекса профилактических мероприятий является важным этапом в борьбе с микотоксикозами. Так в момент возникновения загрязнения токсинами следует изъять корма из хозяйств. Если же данное условие выполнить невозможно, то следующим необходимым шагом становится минимизация последствий отравления живых организмов [13]. В данном случае ветеринарные специалисты успешно используют энтеросорбенты различной природы и их комбинации. Алюмосиликатный пористый сорбент цеолит зарекомендовал себя как наиболее эффективный и доступный при подострых Т-2 токсикозах животных [9].

Перспективным направлением в разработке средств профилактики и лечения животных является применение средств, способствующих адаптации иммунитета животных к вредным факторам различной этиологии. Данными свойствами обладает природный иммуностимулятор – пчелиный подмор, являющийся уникальным, безвредным и богатым по биологическому составу апипродуктом [2].

Целью данного исследования является обоснование компонентного состава, разработанного комплексного профилактического средства в отношении Т-2 токсина в опытах in vitro.

Материал и методы исследований. Работа выполнена на базе лаборатории микотоксинов отделения токсикологии ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (г. Казань). На начальном этапе подбора процентного соотношения основных действующих веществ в составе комплексного профилактического средства «Цеапитокс» с сорбционными свойствами при микотоксикозе проведено исследование адсорбционной активности in vitro по отношению к Т-2 токсину. Адсорбционную способность определяли по двухфазной методике, описанной Крюковым В.С. и соавт. (1992) с изменениями, учитывающими специфику выявления Т-2 токсина [4, 6].

Первая фаза представляла собой помещение сорбирующих компонентов (50 мг) с Т-2 токсином (50 мкг) в кислую среду (5 мл водно-солевого раствора, рН=2) с температурой 37 ° С на 30 минут для имитации условий нахождения в желудке. В этот период происходило связывание (адсорбция) микотоксина. Далее, раствор центрифугировали 15 минут при 3000 оборотах в минуту. Затем раствор фильтровали, фильтрат после добавления ацетона (1:3) через 15 минут экстрагировали. Далее проводили переэкстракцию не адсорбированного микотоксина в хлороформ (два раза по 20 мл). Экстракты с хлороформом объединяли и выпаривали досуха на ротационном испарителе. Во второй фазе образованный комплекс сорбента и Т-2 токсина перемещали в щелочную среду (рН=8) с аналогичными температурными условиями первой фазы на 60 минут для имитаций условий нахождения в кишечном тракте. В представленном состоянии происходило высвобождение микотоксина (десорбция). Далее раствор также центрифугировали.

Содержание микотоксина в супернатанте определяли методом конкурентного иммуноферментного анализа с помощью тест-систем

«Ridascreen T-2 toxin» (R-Biopharm, Германия).

Впоследствии оценивали разницу процента адсорбции и процента десорбции, что дало в результате истинное значение сорбции. Благодаря данному показателю можно обоснованно сделать выводы об эффективности потенциальных сорбционных свойств исследуемых веществ. Адаптогены по отдельности (цеолит и пчелиный подмор), а также вместе («Цеапитокс») рассмотрены как средство для профилактики Т-2 токсикоза и представлены в исследованиях под следующими шифрами: 1) «1Ц» – цеолит Шатрашанского месторождения; 2) «2ПП» – пчелиный подмор; 3) «3Ц» – смесь цеолита и пчелиного подмора (9:1); 4) «4Ц» – смесь цеолита и пчелиного подмора (8:2); 5) «5Ц» – смесь цеолита и пчелиного подмора (9,5:0,5).

Результат исследований.

Результаты сравнительной оценки сорбционной способности компонентных составов по отношению к микотоксину Т-2 в кислой (рН=2) и слабощелочной (рН=8) средах при температуре желудочнокишечного тракта 37 ° С представлены на рисунке 1.

При попадании в кислую среду при рН=2 выявлена тенденция возрастания адсорбционной способности компонентных составов в следующей последовательности: «2ПП» – 32,2 %, «3Ц» – 66 %, «4Ц» – 66 %, «1Ц» – 69 %, «5Ц» – 70 %.

В опыте по определению процента десорбции при рН=8 установлено, что исследуемые адаптогены образовывали менее прочные и стабильные связи с Т-2 токсином. Так процент десорбции у компонентных составов в той же последовательности составил «2ПП» – 5,29 %, «3Ц» – 6,28 %, «4Ц» – 3,64 %, «5Ц» – 5,71 %. У компонентного состава «1Ц» десорбция отсутствовала, что связано с высокой адсорбционной способностью в опыте при рН=2.

При подсчете процента истинной сорбции выявлено, что максимальной сорбционной способностью обладает «1Ц» – 67 %. Более близким к значению этой группы является «5Ц» с истинной сорбцией в 66 %. Также хороший процент истинной сорбции показали компонентные составы «3Ц» и «4Ц», что составило 61,5 и 63,6 %.

Самый низкий процент сорбции оказался у компонентного состава «2ПП» и составил 32,2 %.

Рисунок 1  – Сорбционная способность исследуемых соотношений компонентов профилактического средства «Цеапитокс» в отношении Т-2 токсина

Таким образом, для дальнейших исследований определен компонентный состав профилактического средства «Цеапитокс» под шифром «5Ц», представляющий смесь цеолита (95 %) и пчелиного подмора (5 %). Разница в значении истинной сорбции между «5Ц» и «1Ц» (100 % цеолит) – 1 %, что не имеет существенного значения, принимая во внимание тот факт, что комбинация цеолита и пчелиного подмора оказывает не только сорбционное, но и выраженное иммуностимулирующее действие.

Заключение. Результаты исследования позволили определить компонентный состав комплексного профилактического средства «Цеапитокс» с антитоксическим и иммуностимулирующим действием. Его композицию составляют цеолит – 95 % и пчелиный подмор – 5 %. Адсорбционная способность средства «Цеапитокс» к Т-2 токсину составила 66 %. Следующим не менее важным этапом в исследовании средства «Цеапитокс» является подтверждение сорбционной активности в опытах in vivo.

Резюме

В качестве стимулятора (адаптогена) рассмотрен уникальный, безвредный и богатый по биологическому составу среди многочисленных апипродуктов порошок пчелиного подмора. В связи с этим проведено обоснование компонентного состава разработанного комплексного профилактического средства в отношении Т-2 токсина в опытах in vitro, что и явилось целью данной работы. Исследовательская работа выполнена на базе лаборатории микотоксинов отделения токсикологии ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (г. Казань). Результаты исследования позволили определить компонентный состав комплексного профилактического средства «Цеапитокс» с антитоксическим и иммуностимулирующим действием. Его композицию составляют цеолит – 95 % и пчелиный подмор – 5 %. Адсорбционная способность средства «Цеапитокс» к Т-2 токсину составила 66 %.