Образование ксилита и этанола штаммами ксилозоассимилирующих дрожжей Pachysolen tannophilus различной плоидности

Обогащенные D-ксилозой растворы – продукты гидролиза растительной биомассы (подсолнечная лузга, кукурузная кочерыжка, сульфитный щелок и т. д.) являются субстратами для образования ксилита и этанола [10], [12], [14]. Уникальная способность накапливать их сопоставимые количества делает вид Pachysolen tannophilus удобной экспериментальной моделью для изучения фундаментальных и прикладных аспектов катаболизма D-ксилозы [8]. Однако внутрипо-пуляционная гетерогенность этих ксилозоассимилирующих дрожжей существенно затрудняла выделение и анализ штаммов различной плоид-ности [9]. В ходе предварительных экспериментов нам удалось определить факторы, регулирующие жизненный цикл P. tannophilus , а также подобрать условия для инкубирования вегетативной гаплоидной и диплоидной культуры [4].

Ранее было показано, что образование ксилита и этанола из D-ксилозы у дрожжей тесно ассоциировано с ростом [3]. Известно, что синтез так называемых первичных метаболитов часто коррелирует с плоидностью дрожжевой клетки [1], [2]. Поэтому цель настоящей работы заключалась в сравнительном анализе эффективности накопления ксилита и этанола изогенными (гаплоидным и диплоидным) штаммами P. tannophilus .

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали гаплоидный штамм 22-Y-1532, полученный из хорошо спорулирующей культуры Y-1532 P. tannophilus (ВКПМ ВНИИ Генетика, Москва) стандартной методикой [7], а также изогенный диплоид 1Д-22–Y-1532, выделенный согласно [4]. Микроаэробную ферментацию проводили в 250 мл колбах Эрленмейера со 100 мл жидкой среды с 2 % D-ксилозой [8] на термостатированной круговой качалке УВНТ-12-250 при 100 об./мин и 30 ± 2 °С в течение 24 часов. Посевной материал выращивали аналогично [9]. Внутрипопуляционную устойчивость штаммов P. tannophilus изучали с помощью микроскопа Jenamed variant (Германия) при увеличении окуляра и объектива соответственно в 18 и 40 раз. Пробы для анализа отбирали в среднем через каждые 2 часа, устанавливая размер и форму клеток, характер почкования, а также споруляции [4], [9].

После окончания ферментации биомассу дрожжей отделяли на центрифуге ПК-6 в течение 5–10 минут при 5000 об./мин. Ее концентрацию рассчитывали по методу Лоури [13] спектрофотометрически на приборе СФ-46 (СССР) при длине волны 620 нм. Содержание D-ксилозы определяли по Феллингу. Этиловый спирт и ксилит анализировали методами газовой хро- матографии на приборе Vista 600 (Varian, США) согласно условиям, отраженным в [8]. Статистическую обработку экспериментальных данных проводили стандартными методами [6].

РЕЗУЛЬТАТЫ

Установлено, что ксилит в дрожжевой клетке образуется из D-ксилозы под действием ферментов НАД(Ф)Н-зависимой D-ксилозоредуктазы (ЕС 1.1.1.21) и ДНФ-ксилитол (D-ксилулозо)-дегидрогеназы (ЕС 1.1.1.9). Его использование в гликолитическом пути Эмбдена – Мейергофа – Парнаса опосредовано реакциями неокислительной стадии пентозофосфатного цикла [8], [15]. Очевидно, что ксилит и этанол могут накапливаться лишь при жестком ограничении роста и размножения дрожжей. Чаще всего таким ограничивающим (лимитирующим) фактором является недостаточное снабжение питательной среды кислородом. Поэтому ферментацию D-ксилозы изогенными штаммами P. tannophilus осуществляли в так называемом микроаэробном режиме [3].

Популяционная устойчивость оказывает непосредственное влияние на скорость роста продуцента, его жизнеспособность в присутствии микроорганизмов – контаминантов, а также эффективность конверсии субстрата в целевой продукт [1], [5]. Коллекционные варианты P. tan-nophilus – гетерогенные популяции клеток различной плоидности, не имеющие биотехнологической значимости [9]. Идентификация факторов, регулирующих динамику жизненного цикла этого вида, позволила нам стабилизировать изогенные диплоид и гаплоид на плотной питательной среде с D-ксилозой [4]. Их поведение в аналогичной по составу источников углерода жидкой ферментационной среде оставалось неизученным. Поэтому размер, форму клеток гаплоидного (22–Y-1532) и диплоидного (1Д-22–Y-1532) штаммов P. tannophilus , характер почкования, а также индукцию споруляции (показатель возникающей гетерогенности культуры) анализировали, учитывая критерии [4], [9] в ходе микроаэробной биоконверсии D-ксилозы (см. рисунок).

22-Y-1532 P.tannophilus (n)

Популяционная устойчивость изогенных штаммов ксилозоассимилирующих дрожжей P. tannophilus : размер крупных клеток – (6,3–8,4) х (4,2–6,3) мкм; мелких клеток – (1,3–6,3) х (2,1–4,2) мкм

Оба штамма имели близкую динамику роста. Тем не менее гаплоид P. tannophilus отличала устойчивость на протяжении всего периода ферментации. Вероятно, именно она способствовала лучшему приросту биомассы этого штамма (∆, см. таблицу). Напротив, уже к 12-му часу эксперимента 40 % популяции диплоида составляли мелкие гаплоидные клетки, появившиеся в результате диссоциации. Однако степень потребления D-ксилозы, концентрация, а также экономический коэффициент образования ксилита у диплоидного штамма оказались выше. Аналогичная тенденция была зафиксирована для этанола. Незначительное увеличение продукции спирта, который, в отличие от ксилита, появляется лишь на заключительных этапах гликолиза, хорошо объясняется активной диссоциацией культуры 1Д-22–Y-1532 P. tannophilus (см. рисунок и таблицу). Таким образом, результаты указывают на существование взаимосвязи между плоидностью клеток P. tannophilus и эффективностью накопления ксилита и этилового спирта из D-ксилозы. В то же время ее характер нельзя определить без дополнительных исследований.

Микроаэробная ферментация D-ксилозы штаммами P. tannophilus различной плоидности

Примечание. * – экономический коэффициент образования ксилита (этанола или биомассы) в расчете на грамм потребленной D-ксилозы. Относительная ошибка в каждой экспериментальной точке не превышает 5 %.

Образование ксилита и этанола штаммами ксилозоассимилирующих дрожжей Pachysolen tannophilus ...

ОБСУЖДЕНИЕ

Возможность рационального осуществления того или иного метаболического процесса в промышленных условиях зависит от целого комплекса факторов. Наиболее важными из них являются технологические особенности продуцента: скорость роста, метаболическая активность, интенсивность потребления субстрата, устойчивость культуры в ходе ферментации и т. п. [5]. Именно они стали причиной широкого использования полиплоидов Saccharomyces cerevisiae в различных отраслях народного хозяйства. Тесная взаимосвязь между плоидно-стью генома данного вида, продуктивностью и скоростью образования этанола уже не вызывает сомнения [1].

Попытки создать аналогичные линии дрожжей P. tannophilus , находящихся большей частью в гаплофазе жизненного цикла, уже предпринимались за рубежом. Некоторые линии дрожжей отличала улучшенная способность продуцировать ксилит и этиловый спирт в ходе микро-аэробной ферментации D-ксилозы [11], [12]. Тем не менее они, как и диплоид 1Д-22–Y-1532 P. tannophilus , активно диссоциировали. Это указывает на необходимость дополнительной идентификации факторов, стабилизирующих такие штаммы в жидких ферментационных средах. Их анализ может стать важной предпосылкой для успешного конструирования продуцентов этанола и ксилита на основе коллекционных вариантов ксилозоассимилирующих дрожжей.

* Работа выполнена при поддержке грантов Программы Президента РФ «Ведущие научные школы» (НШ-3731.2010.4 и НШ-1642.2012.4) и Программы стратегического развития (ПСР) ПетрГУ в рамках реализации комплекса мероприятий по развитию научно-исследовательской деятельности на 2012–2016 гг.