Оценка активности аденилатциклазы в тромбоцитах овец после внешнего воздействия G-излучения в различных дозах

Аденилатциклаза – ключевой фермент цАМФ-зависимой сигнальной системы. Активация этой системы осуществляется через трансмембранный каскад: p -адренорецептор - G-белки -аденилатциклаза с помощью гормонов, нейромедиаторов и других соединений, называемых первичными мессенджерами. Выполняя функцию вторичного внутриклеточного мессенджера, цAMФ вызывает метаболические и функциональные сдвиги, изменяющие функции клеток [1]. Через цАМФ-зависимую систему трансмембранной передачи сигналов происходит регуляция метаболизма, пролиферации и дифференцировки клеток, экспрессии генов; она также играет важную роль в кроветворении, клеточном иммунитете, вирусной инфекции, регуляции апоптоза и других процессах [2-4]. Выявлено участие внутриклеточной цАМФ-зависимой системы в поддержании нормального гемостаза и активации тромбоцитов при их агрегации [5]. Получены экспериментальные доказательства участия аденилатциклазной сигнальной системы в увеличении эластичности эритроцитарных мембран и изменении деформируемости эритроцитов [6, 7].

Внешнее воздействие у -излучения приводит в организме млекопитающих к изменению содержания в тканях и периферической крови катехоламинов, кортикостероидов, серотонина и других биологически активных соединений, активирующих определённые сигнальные системы [8]. Отмечены пострадиационные изменения активности ферментов цАМФ-зависимой сигнальной системы в различных клеточных популяциях у лабораторных и сельскохозяйственных животных

Шевченко Т.С.* – главный специалист, к.б.н.; Кобялко В.О. – зав. лаб., к.б.н. ФГБНУ ВНИИРАЭ.

[9-15]. Кроме того, внешнее воздействие γ -излучения на организм животных в дозах 2-10 Гр поражает систему кроветворения, в результате чего резко снижается число клеток костного мозга и периферической крови [8]. Поэтому возникает вопрос, влияет ли такое воздействие на функционирование аденилатциклазы как ключевого фермента цАМФ-зависимой сигнальной системы в клетках периферической крови. Ранее нами было проведено исследование базальной и стимулированной простагландином Е 1 активности аденилатциклазы в лимфоцитах, выделенных из крови овец, подвергнутых общему внешнему воздействию γ -излучения в различных дозах [16].

А целью данной работы стала оценка активности базальной и стимулированной простагландином Е 1 активности аденилатциклазы в тромбоцитах, выделенных из крови овец, подвергнутых общему внешнему воздействию γ -излучения в разных дозах.

Материалы и методы

Эксперимент проведён на 32 овцах цыгайской породы (бараны) со средней живой массой 33,16 ± 0,12 кг в условиях вивария ВНИИРАЭ (Обнинск). Экспериментальные животные были получены из хозяйств Калужской области, имели ветеринарный сертификат и прошли 20-суточный карантин в виварии ВНИИРАЭ. Все работы с животными выполнялись в соответствии с ГОСТ 33215-2014. Рацион был сбалансирован по основным питательным веществам согласно нормам ВНИИ животноводства. Животные были разделены на четыре группы – контрольную (1-я группа, 8 голов) и три опытные (по 8 голов каждая), которых подвергали общему внешнему воздействию γ -излучения на установке «ГУЖ-24», Россия (источник излучения ¹³⁷Cs с энергией гамма-квантов 0,67 МэВ) при мощности дозы 1 Гр/ч.

Определение клинического состояния подопытных животных проводили по показателям, принятым в клинической диагностике сельскохозяйственных животных: общий вид овец, поведение, реакцию на внешние раздражители, аппетит, температуру тела, частоту пульса и дыхания, функциональное состояние желудочно-кишечного тракта, динамику живой массы. Для оценки степени радиационного поражения использовали гематологические показатели: количество эритроцитов, тромбоцитов, лейкоцитов и лейкоцитарную формулу по стандартным методикам. До начала эксперимента биологические и клинические показатели овец контрольной и опытных групп были равноценными. Условия содержания животных контрольной и опытных групп были идентичными.

Животные опытных групп были подвергнуты общему внешнему воздействию γ -излучения в дозах: 2 Гр – 2-я группа, 4 Гр – 3-я группа и 6 Гр – 4-я группа. Контроль уровня и равномерности облучения подопытных животных осуществляли дозиметром «VAJ-18» (Германия) со сферической ионизационной камерой «VAK-253» (Германия). Неравномерность γ -излучения не превышала ± 15%.

Пробы крови отбирали из яремной вены до облучения и на 1-, 3-, 5-, 7-, 10-, 15-, 20- и 30-е сут после воздействия. В качестве антикоагулянта использовали цитрат натрия (конечная концентрация 0,38%). Популяцию тромбоцитов выделяли из периферической крови овец разработанным нами способом [17]. Изолированные клетки промывали 2 раза в растворе, содержащем NaCl, KCl, K2HPO, MgCl2, глюкозу и N-2-(гидроксиэтил)пиперазин N′-2-этансульфоновую кислоту в концентрации 145, 5, 0,5, 1, 3 и 10 ммоль/л соответственно), рН 7,4. Подсчёт количества клеток в полученных суспензиях проводили в камере Горяева. Жизнеспособность выделенных кле- ток, определяемая с помощью окрашивания 0,1%-ным раствором трипанового синего, составляла в среднем 90-95%. Перед проведением ферментной реакции аликвоту суспензии тромбоцитов лизировали с помощью замораживания и оттаивания.

Данные определения базальной и стимулированной активности аденилатциклазы в тромбоцитах всех 32 овец до начала эксперимента рассматривали как объединённый контроль (исходные данные).

Активность аденилатциклазы в лизатах клеток определяли в соответствии с условиями, описанными ранее [18]. В качестве меченых субстратов ферментных реакций использовали [¹⁴С] -АТФ и [³Н] -цАМФ («Amersham», Великобритания). Разделение продуктов ферментных реакций проводили методом тонкослойной хроматографии на пластинах «Силуфол УФ-254» (Чехия). Среда инкубации для анализа активности аденилатциклазы включала: АТФ; ГТФ; МgSO 4 ; этиленгликоль-ди/ β -аминоэтиловый эфир/-N,N-уксусной кислоты (ЭГТА); креатинфосфат; трис-HCl (0,5: 0,1; 10; 2; 5; 50 ммоль/л соответственно), 40 ед/мл креатинкиназы; 37 КБк [¹⁴С]-АТФ (рН 7,4; tº 30 ºС). Гормон-стимулированную активность аденилатциклазы определяли по разнице ферментативной активности с простагландином Е 1 в концентрации 10^-5 моль/л и без него.

Подсчёт радиоактивности всех образцов проводили на жидкостно-сцинтилляционном счётчике «SL-4220» («Intertechnique», Франция).

Статистическую обработку результатов осуществляли с использованием t-критерия Стьюдента и пакета программ Microsoft Excel 2003. Различия между контрольными и опытными значениями считали достоверными при p<0,05.

Результаты и обсуждение

Общее внешнее воздействие γ -излучения в исследованных дозах от 2 до 6 Гр приводило к развитию у животных острого лучевого поражения различной степени тяжести. Клинико-гематологическое обследование овец показало, что доза облучения 2 Гр вызывала лучевое поражение лёгкой степени тяжести, 4 Гр – средней, а 6 Гр – тяжёлой. Облучение овец в дозе 2 Гр не оказывало летального воздействия на животных на протяжении 45 сут наблюдения (сублетальная доза). При воздействии γ -излучения в дозе 4 Гр в течение 45 сут наблюдения погибло 50% овец (LD 50/45 – полулетальная доза) и 100% – при дозе 6 Гр в течение 45 сут (LD 100/45 – летальная доза).

Базальная активность аденилатциклазы – это активность синтезирующего цАМФ фермента, связанного с каталитической субъединицей, в отсутствие стимулирующего или ингибирующего действия на клетку физиологически активных соединений [1]. Величина базальной активности аденилатциклазы в тромбоцитах всех 32 необлучённых овец составила 10,9 ± 1,9 пмоль/мин × 10⁸ клеток, что сравнимо с величиной базальной активности аденилатциклазы в тромбоцитах крупного рогатого скота, равной 13,3 ± 0,4 пмоль/мин × 10⁸ клеток [15]. Базальная активность аденилатциклазы в тромбоцитах контрольных овец практически не менялась в течение всего эксперимента (табл. 1).

После общего внешнего воздействия γ-излучения базальная активность аденилатциклазы в тромбоцитах возрастала на 1-е сут у животных всех трёх опытных групп в 1,77; 2,46 и 3,40 раза соответственно (табл. 1). На 3-и сут базальная активность исследуемого фермента в тромбоцитах овец первых двух опытных групп возвращалась к исходным данным, тогда как в третьей группе повышалась в 1,67 раза. На 5-е сут базальная активность аденилатциклазы увеличивалась в тромбоцитах овец 1-й группы в 3,41 раза и уменьшалась в тромбоцитах 2-й и 3-й групп в 2,14 и 2,6 раза соответственно. На 7-е сут величина показателя у животных 1-й группы мало отличалась от контроля и значительно увеличивалась у овец 2-й и 3-й групп – в 3,54 и 5,15 раза соответственно. При этом у овец 1-й группы базальная активность аденилат-циклазы в тромбоцитах на 10-е сут оказывалась выше в 2,15 раза в сравнении с необлучённы-ми животными, тогда как у животных двух других опытных групп величина показателя возвращалась к исходным данным. На 15-е сут у овец 1-й и 2-й групп наблюдали снижение активности фермента до контрольных значений, а на 20-е сут – в 2,17 и 2,06 раза. На 30-е сут базальная активность аденилатциклазы в тромбоцитах приближалась к исходным данным. Т.е. базальная активность аденилатциклазы в тромбоцитах при общем внешнем воздействии у-излучения на организм овец в изучаемом диапазоне доз заметно увеличивалась на 1-е (при всех дозах), 5-е (при дозе 2 Гр) и 7-е сут (при дозах 4 и 6 Гр). В остальные сроки у разных групп животных отмечали уменьшение величины показателя до контрольных значений и ниже.

Иными словами, у овец, подвергнутых воздействию у -излучения в сублетальной дозе, наблюдали усиление базальной активности аденилатциклазы в тромбоцитах на 1-е, 5-е и 10-е сут. На 20-е сут у этой группы животных отмечали угнетение активности фермента. В остальные сроки исследования базальная активность аденилатциклазы в тромбоцитах соответствовала контрольным значениям. У овец, облучённых в полулетальной дозе, наблюдали активацию базальной активности аденилатциклазы в тромбоцитах на 1-е и 7-е сут и угнетение активности фермента на 5-е и 20-е сут. У животных, подвергнутых внешнему воздействию у -излучения в летальной дозе, отмечали усиление базальной активности аденилатциклазы в тромбоцитах на 1-е и 7-е сут и угнетение – на 5-е сут.

Таблица 1 Базальная активность аденилатциклазы в тромбоцитах (пмоль/мин х 10 8 клеток) облучённых и необлучённых овец

Сроки до и после облучения, сут	Группы животных
	К	1	2	3
Исходный уровень	Объединённый контроль (исходные данные)	10,9 ± 1,9	10,9 ± 1,9	10,9 ± 1,9
1	11,3 ± 1,4	19,3 ± 2,6*	26,8 ± 7,1*	37,1 ± 10,1*
3	10,5 ± 1,2	9,4 ± 2,1	9,7 ± 3,0	18,2 ± 12,6
5	13,7 ± 1,8	37,2 ± 2,0*	5,1 ± 0,6*	4,2 ± 0,8*
7	10,9 ± 1,6	13,6 ± 6,0	38,6 ± 8,6*	56,1 ± 12,1*
10	11,9 ± 1,7	23,4 ± 3,4*	9,5 ± 2,1	7,7 ± 2,2
15	10,8 ± 2,3	14,0 ± 5,7	8,2 ± 0,6*	8,6
20	12,4 ± 1,9	5,0 ± 0,9*	5,3 ± 1,8*	6,9
30	11,2 ± 1,3	11,6 ± 2,3	7,6 ± 1,6	14,5

* Отличия от контроля (исходные данные) достоверны – р<0,05.

Следовательно, при радиационном поражении животных разной степени тяжести были обнаружены изменения базальной активности аденилатциклазы в тромбоцитах, которые носили фазовый характер. Первую фазу активации наблюдали на 1-е сут, вторую – на 5-7-е сут после воздействия. Была также выявлена прямо пропорциональная зависимость базальной активности аденилатциклазы в тромбоцитах от дозы у -излучения на 1-е и 7-е сут (рис. 1).

Рис. 1. Зависимость базальной активности аденилатциклазы от дозы на 1-е и 7-е сут после внешнего воздействия у-излучения.

Стимулированная простагландином Е 1 активность аденилатциклазы в тромбоцитах необ-лучённых овец составила 15,7 ± 5,7 пмоль/мин х 10⁸ клеток (табл. 2). Этот показатель на 1-е сут после общего внешнего воздействия у -излучения в тромбоцитах животных 1-й группы оставался на уровне контроля, а в тромбоцитах животных 2-й и 3-й групп возрастал в 6,85 и 3,64 раза соответственно. На 3-и сут стимулированная активность фермента в тромбоцитах овец 1-й группы была ниже контроля в 1,76 раза, в тромбоцитах 2-й группы – в 2,38 раза, а в клетках 3-й группы, напротив, возрастала в 3,64 раза. На 5-е сут стимулированная активность аденилат-циклазы в тромбоцитах овец 2-й и 3-й групп возвращалась к исходным данным, а на 7-е сут значения показателя в тромбоцитах овец всех опытных групп (1-й, 2-й и 3-й) были в 1,63, 5,70 и 9,05 раза выше контроля соответственно. На 10-е сут показатель у животных 1-й группы возрастал в 4,97 раза, у 3-й группы – в 4,3 раза, тогда как у овец 2-й группы снижался в 1,6 раза по сравнению с исходным уровнем. На 15-е сут стимулированная активность аденилатциклазы в тромбоцитах овец 1-й и 2-й групп снижалась в 1,91 и 1,89 раза, а на 20 и 30-е сут – возрастала в 2,04 и 1,88 раза у овец 1-й группы и в 2,51 и 1,25 раза у овец 2-й группы. У животных 3-й группы стимулированная активность аденилатциклазы в тромбоцитах на 15-е сут увеличивалась в 2,68 раза, на 30-е сут – в 3,05 раза.

Таблица 2 Стимулированная простагландином Е 1 активность аденилатциклазы в тромбоцитах (пмоль/мин х 10 8 клеток) облучённых и необлучённых овец

Сроки до и после облучения, сут	Группы животных
	К	1	2	3
Исходный уровень	Объединённый контроль (исходные данные)	15,7 ± 5,7	15,7 ± 5,7	15,7 ± 5,7
1	17,2 ± 3,3	13,4 ± 3,4	107,5 ± 27,5*	57,1 ± 19,0*
3	16,5 ± 2,3	8,9 ± 3,4	6,6 ± 6,3	41,0 ± 24,0
5	15,4 ± 1,9	-	13,4 ± 3,4	11,1 ± 3,3
7	17,2 ± 0,8	25,6 ± 7,2	89,5 ± 16,5*	142,1 ± 3,3*
10	13,3 ± 2,5	70,2 ± 21,7*	9,8 ± 4,5	67,5 ± 29,5*
15	13,5 ± 1,7	8,2 ± 3,1	8,3 ± 0,3	42,1
20	15,6 ± 1,9	32,1 ± 2,7*	39,4 ± 2,7*	41,7
30	16,4 ± 2,4	29,5 ± 11,0	19,7 ± 3,6	48,0

* Отличия от контроля (исходные данные) достоверны – р<0,05.

Иными словами, у животных, подвергшихся общему внешнему воздействию γ -излучения в дозах от сублетальной до летальной, наблюдали изменение стимулированной простагландином Е 1 активности аденилатциклазы в тромбоцитах. После воздействия γ -излучения в сублетальной дозе величина показателя возрастала на 7-е, 10-е, 20-е и 30-е сут (в 1,6-4,5 раза). При полулетальной дозе стимулированная простагландином Е 1 активность аденилатциклазы в тромбоцитах овец возрастала на 1-е, 7-е и 20-е сут (в 2,5-6,9 раза). После облучения животных в летальной дозе активность фермента в тромбоцитах была увеличенной во все исследованные сроки (в 2,6-9,1 раза), кроме 5-х сут, когда величина показателя приближалась к исходным данным. Т.е. у животных, подвергнутых общему внешнему воздействию γ -излучения, выявили усиление стимулированной простагландином Е 1 активности аденилатциклазы в тромбоцитах на 1-е, 7-10-е и 20-30 сут. В остальные сроки отмечали угнетение стимулированной активности фермента, значения которой были ниже контрольных. Была также выявлена прямо пропорциональная зависимость стимулированной простагландином Е 1 активности аденилатциклазы в тромбоцитах от дозы γ -излучения на 7-е сут (рис. 2).

Рис. 2. Зависимость, стимулированная простагландином Е 1 , активности аденилатциклазы от дозы на 7-е сутки после внешнего воздействия γ -излучения.

Таким образом, с 1-х сут после внешнего воздействии γ -излучения на организм овец в дозах от сублетальной до летальной обнаружили выраженные изменения базальной и стимулированной активности аденилатциклазы в тромбоцитах.

Следовательно, в начальный период радиационного поражения овец была выявлена определённая детерминанта постлучевых процессов в ключевом ферменте системы цАМФ – аденилатциклазе. Аденилатциклаза является трансмембранным ферментным комплексом, состоящим из двух субъединиц: каталитической и регуляторной [1]. Процессы, происходящие в этом ферментном комплексе после воздействия внешнего γ -излучения in vivo, затрагивают обе эти субъединицы, поскольку базальная активность аденилатциклазы связана с каталитической субъединицей фермента, а стимулированная – с регуляторной. Функциональная активность фермента в первую очередь зависит от конформации макромолекулы и её взаимодействий с мембранными составляющими, так как аденилатциклаза встроена в цитоплазматическую мембрану клетки [8]. Известно, что биологические мембраны, наряду с ДНК, рассматриваются в качестве одной из мишеней воздействия ионизирующей радиации на клетки [19]. Поэтому ранние изменения активности аденилатциклазы могут быть инициированы радиационно-индуцированным нарушением структурно-функционального состояния плазматических мембран исследованных клеток.

В то же время, может быть и другая причина модификации активности фермента в тромбоцитах при облучении овец, поскольку наблюдаемые изменения и базальной, и стимулированной простагландином Е 1 активности аденилатциклазы в разные сроки весьма различны.

Тромбоциты - небольшие (с диаметром 2-4 мкм) дисковидные безъядерные клетки, образующиеся при фрагментации своих предшественников мегакариоцитов в костном мозге. Срок их жизни в кровеносном русле составляет в норме 5-10 сут, в результате чего к 7-10-м сут тромбоцитарная популяция в периферической крови значительно обновляется [20]. И если воздействие Y -излучения на активность аденилатциклазы в тромбоцитах в начальный период лучевого поражения реализуется, в основном, через нарушения в цитоплазматической мембране, то изменение активности фермента на 7-10-е сут, по-видимому, связано с выходом в кровь новых клеток из пула мегакариоцитов костного мозга с качественно иными свойствами. При этом у «обновлённой» популяции тромбоцитов у овец, облучённых в суб- и полулетальной дозах в период разгара лучевой патологии (15-е сут), была значительно снижена стимулированная простагландином Е 1 активность аденилатциклазы, т.е. ухудшена эффективность передачи гормонального сигнала в клетки.

Следовательно, развитие острой лучевой патологии овец при внешнем воздействии у -излучения в дозах от сублетальной до летальной сопровождается модификацией функционирования аденилатциклазы в относительно радиорезистентных тромбоцитах. Модификация функционирования аденилатциклазы в тромбоцитах овец, проявляя фазовый характер изменений, является зависимой от степени радиационного поражения на 1-е и 7-е сут. Необходимо отметить, что лучевое поражение организма млекопитающих разной степени тяжести опосредуется влиянием радиации на мембраносвязанную аденилатциклазную или цАМФ-зависимую сигнальную систему, осуществляющую регуляцию метаболизма клеток. В связи с этим, можно предположить, что радиационно-индуцированное изменение функционирования цАМФ-зависимой сигнальной системы в тромбоцитах может приводить к искажению клеточных ответов на воздействие нейрогуморальных сигналов. В результате этого возможны проявления дис-координации биохимических и физиологических процессов, возникновение внутриклеточных повреждений, оказывающих влияние на способность тромбоцитов к агрегации и адгезии, а, кроме того - инициированию их гибели.

Заключение

Экспериментальные данные, полученные в работе, свидетельствуют о том, что общее внешнее воздействие Y -излучения на организм овец в дозах от сублетальной до летальной вызывает пострадиационные изменения активности аденилатциклазы в тромбоцитах. Изменения активности аденилатциклазы в ранние сроки могут быть инициированы радиационно-индуцированной модификацией структурно-функционального состояния плазматических мембран исследованных клеток и нарушением функционирования мембраносвязанной цАМФ-зави-симой сигнальной системы. Изменение активности фермента на 7-10-е сут, по-видимому, связано с выходом в кровь новых клеток тромбоцитов из пула мегакариоцитов костного мозга с качественно иными свойствами.

Результаты выполненных исследований дополняют современные представления о характере формирования радиационного ответа при облучении в высоких дозах, могут быть полезными при прогнозировании последствий пострадиационных нарушений.