Оценка бактериального состава сметаны с помощью высокопроизводительного секвенирования

Сметана – кисломолочный продукт, изготавливаемый на основе сливок и стартовых культур молочнокислых бактерий [1]. Это традиционный продукт во многих странах, который ценится за свои вкусовые характеристики и состав, насыщенный питательными веществами [2]. Многочисленные исследования показали положительное влияние молочнокислых продуктов на здоровье человека, как за счёт самих бактерий, входящих в состав, так и за счёт биоактивных элементов, выделяемых в процессе ферментации [3–5]. Было доказано положительно влияние молочнокислых бактерий на состояние желудочно-кишечного тракта человека [6].

В качестве основных микроорганизмов, применяемых при производстве ферментированных молочных продуктов, в том числе и сметаны, используются бактерии родов Streptococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Pedi-ococcus и Enterococcus [7]. Для того чтобы

This is an open access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution 4.0 International License

определить бактериальный состав молочнокислой продукции, сегодня используются не только классические методы, основанные на культивировании на питательных средах [8, 9], но и современные быстрые и точные методики, к которым относится высокопроизводительное секвенирование. Эта методика значительно облегчила изучение сложной микробиоты продуктов питания [10].

Работы, посвященные изучению микробиологического состава сметаны, не многочисленны. Как правило, это комплексные исследования микробных сообществ в различных кисломолочных продуктах, динамики их состава в процессе ферментации [11–13]. Так, например, в 2018 китайские исследователи анализировали традиционные сметану и масло, изготавливаемые коренными жителями Бурятии, на основе комбинации методик секвенирования SMRT и масс-спектрометрии [14].

В связи с этим, цель нашей работы заключалась в проведении анализа бактериального состава коммерчески доступной сметаны на основе высокопроизводительного секвенирования.

Материалы и методы

В качестве объектов исследования было использовано 12 образцов 20%-ой сметаны различных производителей, доступных на территории Российской Федерации. Для выделения ДНК был использован коммерческий набор FаstDNА™ Spin Kit (MP Biomedicals, США).

Изготовление библиотек осуществлялось на основе ПЦР с использованием универсальных праймеров [15, 16] к области V4 гена 16S рРНК на основе методики, описанной ранее [17]. Нуклеотидные последовательности праймеров указаны в таблице 1 .

Таблица 1. Универсальные бактериальные праймеры для проведения секвенирования

Table 1.

Universal bacterial sequencing primers

Праймер Primer	Нуклеотидная последовательность Nucleotide sequence
515F	5'-GTGBCAGCMGCCGCGGTAA-3'
Pro-mod-805R	5'- GACTACNVGGGTMTCTAATCC-3'

На каждый из 12 образцов приходилось по две библиотеки, секвенирование которых осуществлялось параллельно, с использованием набора реагентов MiSeq Reagent Micro Kit v2 (300 циклов) MS-103–1002 (Illumina, США)

на секвенаторе MiSeq (Illumina, США), считывающим 150 п.н. с каждого конца.

Биоинформатический анализ данных, полученных в результате секвенирования, позволил выяснить распределение последовательностей по рабочим таксономическим единицам (OTU) на основе их сходства, которое составляло более 97%. Идентификация OTU осуществлялось на основе программы SILVАngs 1.3 [18].

Результаты и обсуждение

Высокопроизводительное секвенирование позволило выявить данные о фактическом бактериальном составе всех анализируемых образцов. В работе были учтены только те таксоны бактерий, чьё процентное соотношение превышало 1% от общего числа идентифицированных бактерий. Результаты анализа представлены в таблице 2.

Таблица 2.

Идентифицированные роды бактерий в образцах сметаны

Table 2.

Identified genera of bacteria in sour cream samples

Образец сметаны Sour cream sample	Выявленный состав Revealed composition	Процентное содержание в образце Percentage in the sample
1	Streptococcus	97%
	Enterococcus	3%
2	Streptococcus	80%
	Lactococcus	19%
3	Streptococcus	95%
	Lactococcus	3%
	Lacticaseibacillus	2%
4	Streptococcus	83%
	Lactococcus	17%
5	Streptococcus	38%
	Lactococcus	61%
6	Streptococcus	56%
	Lactococcus	44%
7	Streptococcus	85%
	Lactococcus	14%
8	Streptococcus	100%
9	Streptococcus	53%
	Lactococcus	46%
10	Streptococcus	70%
	Lactococcus	28%
	Lacticaseibacillus	2%
11	Streptococcus	85%
	Lactococcus	15%
12	Streptococcus	78%
	Lactococcus	22%

По результатам анализа было установлено, что все 12 образцов сметаны содержали в своём составе бактерии рода Streptococcus . Их процентное соотношение варьировало от 38% (образец № 5) до 100% (образец № 8). В 9 из 12 образцов доминировали бактерии Streptococcus . Их содержание превышало 70%. Это образцы под номерами 1–4, 7, 8, 10–12. Необходимо отметить, что образец сметаны № 8 определился как однокомпонентный продукт, т. е. в его составе были обнаружены только представители рода Streptococcus (рисунок 1).

На втором месте по встречаемости в исследованной продукции располагались представители рода Lactococcus . 83% исследованных образцов включали в состав представителей данного рода. Так, например, в сметане под номерами 5, 6 и 9 содержание Lactococcus составляло 61%, 44% и 46% соответственно. Процентное соотношение бактерий Lactococcus в остальных образцах не превышало 28%.

Образцы № 3 и № 10 характеризовались трехкомпонентным составом. В данной сметане помимо Streptococcus и Lactococcus , было выявлено наличие представителей рода Lacticasei-bacillus , чьё содержание в обоих образцах составило 2%. На рисунке 2 изображено процентное соотношение бактерий в составе сметаны № 3.

Образец сметаны под номером 1 отличался от остальных образцов наличием в составе помимо Streptococcus бактерий рода Enterococcus (3%) (рисунок 3).

Рисунок 1. Процентное содержание бактерий в образце сметаны № 8

Figure 1. The percentage of bacteria in sour cream sample No. 8

Рисунок 2. Процентное содержание бактерий в образце сметаны № 3

Figure 2. The percentage of bacteria in sour cream sample No. 3

Рисунок 3. Процентное содержание бактерий в образце сметаны № 1

Figure 3. The percentage of bacteria in sour cream sample No. 1

Следующий этап исследования заключался в определении видовой принадлежности обнаруженных микроорганизмов. Нуклеотидные последовательности, полученные в результате секвенирования, были проанализированы с помощью системы Nucleotide BLAST. Такой анализ строится на сопоставлении нуклеотидных последновательностей с последовательностями, ранее занесенными в международную базу данных (таблица 3).

Таблица 3.

Видовая принадлежность обнаруженных бактерий в образцах сметаны

Table 3.

Species of bacteria detected in sour cream samples

Образец сметаны Sour cream sample	Вид Species	Совпадение в GenBank, % Compliance with GenBank, %
1	Enterococcus faecium	100,00
	Streptococcus thermophilus	99,26
2	Lactococcus lactis	100,00
	Streptococcus thermophilus	99,58
3	Streptococcus thermophilus	99,25
	Lactococcus lactis	98,80
	Lacticaseibacillus rhamnosus	98,41
4	Streptococcus thermophilus	98,40
	Lactococcus lactis	100,00
5	Streptococcus thermophilus	98,74
	Lactococcus lactis	100,00
6	Streptococcus thermophilus	98,80
	Lactococcus lactis	99,60
7	Streptococcus thermophilus	98,80
	Lactococcus lactis	99,60
8	Streptococcus thermophilus	98,40
9	Streptococcus thermophilus	98,80
	Lactococcus lactis	100,00
10	Lactococcus lactis	98,80
	Streptococcus thermophilus	98,00
	Lacticaseibacillus rhamnosus	98,01
11	Lactococcus lactis	99,20
	Streptococcus thermophilus.	97,80
12	Lactococcus lactis	100,00
	Streptococcus thermophilus	98,80

Было установлено, что в состав заквасочных культур входили Lactococcus lactis, Streptococcus thermophilus, Lacticaseibacillus rhamnosus (для образцов № 3 и № 10) и

Enterococcus faecium (для образца № 1). Все бактерии, идентифицированные в образцах сметаны, входили в состав культур молочнокислых бактерий, используемых при производстве кисломолочной продукции. Так, Lactococcus lactis активно применяется в ферментации за счёт высокой метаболической стабильности и способности образовывать кислоты в молоке, тем самым влиять на вкусовые характеристики конечного продукта [19]. Одной из коммерчески важнейших заквасочных культур явялется Streptococcus thermophilus . Эти бактерии участвуют в метаболизме белков и сахаров, а также формировании ароматов [20]. Использование в производстве Lacticaseibacillus rhamnosus связано с его пробиотическими свойствами и со способностью подавлять рост и развитие плесени в готовой молочной продукции [21]. Бактерии Enterococcus faecium обладают протео-, эстеро- и липолитечской активностью, что обеспечивает формирование специфических текстурных, ароматических и вкусовых характеристик [22].

Заключение

В ходе проведения высокопроизводительного секвенирования 12 образцов сметаны было выяснено, что доминирующим компонентами микробных сообществ каждого из них являлись бактерии двух родов – Streptococcus и Lactococcus . Бактерии рода Streptococcus встречались во всех образцах сметаны. Что касается рода Lactococcus , 11 из 12 образцов сметаны содержали в своём составе представителей данного таксона. Процентное соотношение Lactococcus относительно других компонентов в образцах не превышало 28%. Сметана под номерами 3 и 10 помимо представителей вышеуказанных родов содержала Lacticaseibacillus (по 2% для каждого из образцов). В сметане № 1 по результатам анализа 3% приходилось на представителей рода Enterococcus .

Полученные результаты свидетельствуют о наличие в бактериальном составе исследованных образцов сметаны представителей культур молочнокислых бактерий, традиционно используемых в качестве заквасок при производстве кисломолочной продукции. Составы были представлены Lactococcus lactis, Streptococcus thermophilus, Lacticaseibacillus rhamnosus и Enterococcus faecium .