Оценка безопасности штаммов Bacillus subtilis, выделенных из природной среды Якутии

Обеспечение биобезопасности является важной государственной задачей. В последние годы быстро растет количество бактерий с лекарственной устойчивостью. Резистентность патогенных микроорганизмов к антимикробным препаратам широко распространена и является важнейшим фактором снижения эффективности лечения инфекционных заболеваний [1]. В связи с этим в настоящее время актуальным является поиск перспективных штаммов-продуцентов биологически активных веществ, ферментов для разработки и производства биопрепаратов и кормовых добавок с целью получения экологически чистой животноводческой продукции.

Большинство бактерий представлены в виде одноклеточных микроорганизмов, которые проявляют ряд сложных социальных признаков, таких как коммуникация, роевая подвижность, регуляция скоординированной экспрессии генов и т.д., подобно высшим многоклеточным организмам. На сегодняшний день бактерии рода Bacillus в практике ветеринарной микробиологии представляют особую ценность, т.к. являются основой ряда лекарственных средств, пробиотиков и кормовых ферментных добавок, а также препаратов, предназначенных для защиты растений от грибковых и бактериальных болезней [6]. Разработка и дальнейшее использование препаратов на бактериальной основе требует тщательных исследований безопасности действующего вещества и их компонентов на лабораторных животных [4, 9].

Род Bacillus представлен грамположительными, аэробными и спорообразующими микроорганизмами, обладающими широким спектром применения в сельскохозяйственных отраслях, включая производство пробиотических препаратов, а также использование их в качестве основы ферментативных препаратов для расщепления различных субстратов – целлюлозы, крахмала, пектина, белка и т.д. [2].

Известно, что в желудочнокишечном тракте животных содержатся различные бактерии, которые составляют микробиоту. Их балансированное содержание чрезвычайно важно для переваривания поступающей пищи и поддержания общего иммунитета организма. Согласно литературным данным, бактерии вида B. subtilis доминируют в микробиоте диких животных и мерзлотных почвах [3, 8]. Они поддерживают сбалансированное пищеварение и помогают бороться с патогенными бактериями. Использование этого вида бактерий в животноводстве подытоживается широким спектром их положительного воздействия на организм животного.

В настоящее время в сельскохозяйственной науке наблюдается повышенный интерес к бактериям вида B.

subtilis из-за их выраженных биологических активностей, что стимулирует ученых к поиску новых штаммов микроорганизмов. Важным аспектом для реализации препаратов на основе микроорганизмов является отсутствие у них патогенности к сельскохозяйственным животным. Патогенность основывается на токсигенных и вирулентных свойствах микроорганизмов по отношению к живым организмам.

Исходя из вышеизложенного, целью данной работы является определение наличия токсигенности и вирулентности штаммов В. subtilis, выделенных из мерзлотных почв и микробиоты диких копытных животных.

Материал и методы исследований. Опыты in vivo по определению безопасности (токсигенность, вирулентность) штаммов B. subtilis , выделенных из мерзлотных почв и микробиоты диких копытных животных, проведены на лабораторных животных в лаборатории по разработке микробных препаратов Якутского научноисследовательского института сельского хозяйства им. М.Г. Сафронова, согласно «Методических рекомендаций по выделению и идентификации бактерий группы Bacillus subtilis-mesentericus из организма человека и животных» [7]. Исследованы 17 штаммов: B. subtilis -1р, B. subtilis -2р, B. subtilis -4р, B. subtilis -15, B. subtilis -11, B. subtilis -48, B. subtilis -24, B. subtilis -28, B. subtilis -4, B. subtilis -54, B. subtilis -36, B. subtilis -25, B. subtilis -16, B. subtilis -1, B. subtilis -27, B. subtilis -5. Молекулярно-генетическая идентификация штаммов проведена в центре коллективного пользования «ГЕНОМИКА» института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск).

Для изучения токсигенности штаммов B. subtilis выращивали в течение 5 суток на мясо-пептонном бульоне (МПБ) при температуре 37 °C. По истечении срока бульонную культуру центрифугировали при 5000 об/мин в течение 30 мин. Для введения мышам использовали надосадочную жидкость. Культуральную жидкость вводили в дозе по 0,5 мл на 1 голову подкожно. На каждый штамм использовали по 3 белые мыши. Контролем служила группа мышей, получавших стерильный МПБ в дозе по 0,5 мл.

Для определения вирулентности использованы штаммы бактерий B. subtilis после 24-часового роста на мясопептонном агаре. После смыва с агара готовили 5 млрд взвесь в физиологическом растворе. Суспензии вводили однократно внутрибрюшинно по 0,5 мл (5х10⁹ КОЕ/мл) на голову. На каждый штамм использовали по 3 белые мыши. Животным контрольной группы вводили физиологический раствор в аналогичных объемах.

За подопытными животными вели наблюдение в течение 10 дней после проведения манипуляций, учитывая общее клиническое состояние: состояние шерстного покрова, поедаемость корма и потребление воды. Критерием оценки по тестам являлось отсутствие проявления симптомов интоксикации и гибели подопытных. Вели учет живой массы до и после опыта.

Математическую обработку полученных данных осуществляли с использованием прикладной программы Snedecor, Microsoft Excel. Результаты опытов подвергли также статистической обработке по методу Стьюдента.

Результат исследований. В результате проведенных исследований установлено, что все 17 штаммов В. subtilis, выделенные из мерзлотной почвы и кишечной микробиоты диких животных, не обладают токсигенностью и вирулентностью в испытанных концентрациях. Все животные оставались живыми в течение периода наблюдения (10 суток), ни у одного из них не выявлены признаки заболевания (Таблица 1).

В ходе экспериментов в течение 10 дней наблюдения состояние подопытных мышей оставалось удовлетворительным, животные были подвижны, реакция на внешние раздражители и потребляемость пищевых рационов оставались такими же, как и до введения суспензий и супернатантов B. subtilis. Изменения состояния шерстного покрова, а также проявления других симптомов интоксикации отсутствовали. Коэффициент достоверности по Стьюденту у каждой исследованной группы мышей из трех белых лабораторных мышей составил P>0,05.

Таблица 1 – Результаты изучения безопасности штаммов В. subtilis, выделенных от диких копытных животных

№ п/п	о 2 л 5 2 b 5 С св Л н е а к	оа « а S <и S о В и К ч ° о «	св * ё § о 8 Ч и св 2	Токсигенность (п/к по 0,5 мл/гол)			Вирулентность (в/б по 0,5 мл/гол)			х а 2 § а ч а ^ 2	Св' Св нЧ о св Оч О О 8 2
				8 В & 2 о Ч св 6	о о ко	к	S & 2 о Ч св S	о о со	к
1	B. subtilis 1р	3	25,8±1,64	5	0	0	5	0	0	3	27,7±1,43
2	B. subtilis 2р	3	23,4±1,43	5	0	0	5	0	0	3	26,5±1,66*
3	B. subtilis 4р	3	24,1±1,26	5	0	0	5	0	0	3	25,0±1,26
4	B. subtilis 15	3	24,4±1,26	5	0	0	5	0	0	3	27,9±1,15*
5	B. subtilis 11	3	34,0±0,1	5	0	0	5	0	0	3	31,9±1,15
6	B. subtilis 48	3	24,0±1,52	5	0	0	5	0	0	3	24,7±1,99*
7	B. subtilis 5	3	32,0±0,1	5	0	0	5	0	0	3	32,0±1,26
8	B. subtilis 24	3	28,2±1,20	5	0	0	5	0	0	3	28,8±1,43*
9	B. subtilis 28	3	28,1±1,15	5	0	0	5	0	0	3	29,4±1,60*
10	B. subtilis 4	3	24,4±1,43	5	0	0	5	0	0	3	27,5±0,1*
11	B. subtilis 54	3	23,6±1,52	5	0	0	5	0	0	3	23,1±1,25
12	B. subtilis 36	3	30,0±0,1	5	0	0	5	0	0	3	30,0±0,1
13	B. subtilis 25	3	27,5±0,1	5	0	0	5	0	0	3	29,3±1,20*
14	B. subtilis 16	3	30,1±1,20	5	0	0	5	0	0	3	35,8±1,20**
15	B. subtilis 1	3	29,6±1,52	5	0	0	5	0	0	3	21,3±1,15
16	B. subtilis 27	3	21,5±1,43	5	0	0	5	0	0	3	24,6±1,43*
17	Контроль	3	24,7±1,20	5	0	0	5	0	0	3	27,4±1,49*

Примечание: *P >0,05, **Р <0,05

В настоящее время в России прослеживается острая необходимость замещения импортных товаров, в том числе лекарственных средств, ферментных и кормовых добавок. Так, большинство кормовых добавок с пробиотическими и ферментативными свойствами иностранного происхождения, поэтому поиск новых безопасных эффективных штаммов природного происхождения является актуальным для разработки биологических препаратов отечественного производства.

Полученные результаты сопоставимы с изучением токсичности при многократном внутрижелудочном введении препарата «Сахабактисубтил», разработанного на основе штаммов B. subtilis ТНП-3 и B. subtilis ТНП-5 , выделенных из мерзлотных почв крысам

CD (Sprague-Dawley) на протяжении 14 дней разным половозрастным группам и дозам, которые подтвердили безопасность использования и отсутствие токсичности [5]. Также согласуются с тем фактом, что штаммы B. subtilis являются безопасными при производстве пищевых продуктов и квалифицируются статусом презумпции безопасности (QPS) Европейского органа и (GRAS) "общепризнанно безопасная бактерия [10-11]".

Заключение. Таким образом, проведенные исследования показали, что все испытуемые 17 штаммов бактерий Bacillus subtilis , выделенные из мерзлотных почв и микробиоты диких копытных, в исследуемых дозах при однократном подкожном и внутрибрюшном введении не обладают токсигенными и вирулентными свойствами для лабораторных животных.

Полученные результаты позволяют заключить, что штаммы бактерий Bacillus subtilis, выделенные из природной среды Якутии, являются безопасными и могут быть в дальнейшем использованы при разработке биологических препаратов.

Резюме

Разработка и дальнейшее использование препаратов на бактериальной основе требует тщательных исследований безопасности действующего вещества и их компонентов. В статье представлены результаты исследования токсигенности и вирулентности 17-ти штаммов B. subtilis , выделенные из микробиоты диких копытных животных Республики Саха (Якутия).

Токсигенность проверена подкожным введением 0,5 мл супернатантов, вирулентность - внутрибрюшинным введением 0,5 мл суспензии с содержанием 5х10⁹ КОЕ/мл исследуемых штаммов B. subtilis лабораторным животным. Для обеспечения объективности экспериментов суспензию и супернатант одного штамма вводили трем белым лабораторным мышам. Наблюдения за подопытными животными проводились в течение 10-ти дней, во время которых оценивали их общее физиологическое состояние, потребление пищи, увеличение живой массы, состояние шерсти. В ходе экспериментов состояние подопытных мышей оставалось удовлетворительным. Таким образом, 17 штаммов Bacillus subtilis , выделенные из кишечной микробиоты диких копытных животных, не обладают токсигенными и вирулентными свойствами по отношению к лабораторным животным и могут быть перспективными для разработки биологических препаратов.