Оценка безопасности штаммов Bacillus subtilis, выделенных из природной среды Якутии
Автор: Павлов А.Г., Тарабукина Н.П., Маркова А.М., Неустроев М.П., Скрябина М.П.
Статья в выпуске: 3 т.255, 2023 года.
Бесплатный доступ
Разработка и дальнейшее использование препаратов на бактериальной основе требует тщательных исследований безопасности действующего вещества и их компонентов. В статье представлены результаты исследования токсигенности и вирулентности 17-ти штаммов B. subtilis, выделенные из микробиоты диких копытных животных Республики Саха (Якутия). Токсигенность проверена подкожным введением 0,5 мл супернатантов, вирулентность - внутрибрюшинным введением 0,5 мл суспензии с содержанием 5х109 КОЕ/мл исследуемых штаммов B. subtilis лабораторным животным. Для обеспечения объективности экспериментов суспензию и супернатант одного штамма вводили трем белым лабораторным мышам. Наблюдения за подопытными животными проводились в течение 10-ти дней, во время которых оценивали их общее физиологическое состояние, потребление пищи, увеличение живой массы, состояние шерсти. В ходе экспериментов состояние подопытных мышей оставалось удовлетворительным. Таким образом, 17 штаммов Bacillus subtilis, выделенные из кишечной микробиоты диких копытных животных, не обладают токсигенными и вирулентными свойствами по отношению к лабораторным животным и могут быть перспективными для разработки биологических препаратов.
Токсигенность, вирулентность, bacillus subtilis, лабораторные мыши, микробиота, дикие животные
Короткий адрес: https://sciup.org/142238916
IDR: 142238916 | УДК: 579.62 | DOI: 10.31588/2413_4201_1883_2_255_259
Safety assessment of Bacillus subtilis strains isolated from the natural environment of Yakutia
The development and further use of bacterial-based preparations requires thorough safety studies of the active ingredient and their components. The article presents the results of the study of toxigenicity and virulence of 17 strains of B. subtilis isolated from the microbiota of wild ungulates by the Republic of Sakha (Yakutia). Toxigenicity was checked by subcutaneous introduction of 0.5 ml of supernatants, virulence by intraperitoneal introduction of 0.5 ml of suspension containing 5x109 CFU/ml of the studied B. subtilis strains to laboratory animals. To ensure the objectivity of the experiments, the suspension and supernatant of one strain were injected into three white laboratory mice. The experimental animals were observed for 10 days, during which their general physiological condition, food intake, increase in live weight, and hair condition were evaluated. During the experiments, the condition of the experimental mice remained satisfactory. Thus, 17 strains of Bacillus subtilis isolated from the intestinal microbiota of wild ungulates do not possess toxigenic and virulent properties in relation to laboratory animals and can be promising for the development of biological preparations.
Текст научной статьи Оценка безопасности штаммов Bacillus subtilis, выделенных из природной среды Якутии
Обеспечение биобезопасности является важной государственной задачей. В последние годы быстро растет количество бактерий с лекарственной устойчивостью. Резистентность патогенных микроорганизмов к антимикробным препаратам широко распространена и является важнейшим фактором снижения эффективности лечения инфекционных заболеваний [1]. В связи с этим в настоящее время актуальным является поиск перспективных штаммов-продуцентов биологически активных веществ, ферментов для разработки и производства биопрепаратов и кормовых добавок с целью получения экологически чистой животноводческой продукции.
Большинство бактерий представлены в виде одноклеточных микроорганизмов, которые проявляют ряд сложных социальных признаков, таких как коммуникация, роевая подвижность, регуляция скоординированной экспрессии генов и т.д., подобно высшим многоклеточным организмам. На сегодняшний день бактерии рода Bacillus в практике ветеринарной микробиологии представляют особую ценность, т.к. являются основой ряда лекарственных средств, пробиотиков и кормовых ферментных добавок, а также препаратов, предназначенных для защиты растений от грибковых и бактериальных болезней [6]. Разработка и дальнейшее использование препаратов на бактериальной основе требует тщательных исследований безопасности действующего вещества и их компонентов на лабораторных животных [4, 9].
Род Bacillus представлен грамположительными, аэробными и спорообразующими микроорганизмами, обладающими широким спектром применения в сельскохозяйственных отраслях, включая производство пробиотических препаратов, а также использование их в качестве основы ферментативных препаратов для расщепления различных субстратов – целлюлозы, крахмала, пектина, белка и т.д. [2].
Известно, что в желудочнокишечном тракте животных содержатся различные бактерии, которые составляют микробиоту. Их балансированное содержание чрезвычайно важно для переваривания поступающей пищи и поддержания общего иммунитета организма. Согласно литературным данным, бактерии вида B. subtilis доминируют в микробиоте диких животных и мерзлотных почвах [3, 8]. Они поддерживают сбалансированное пищеварение и помогают бороться с патогенными бактериями. Использование этого вида бактерий в животноводстве подытоживается широким спектром их положительного воздействия на организм животного.
В настоящее время в сельскохозяйственной науке наблюдается повышенный интерес к бактериям вида B.
subtilis из-за их выраженных биологических активностей, что стимулирует ученых к поиску новых штаммов микроорганизмов. Важным аспектом для реализации препаратов на основе микроорганизмов является отсутствие у них патогенности к сельскохозяйственным животным. Патогенность основывается на токсигенных и вирулентных свойствах микроорганизмов по отношению к живым организмам.
Исходя из вышеизложенного, целью данной работы является определение наличия токсигенности и вирулентности штаммов В. subtilis, выделенных из мерзлотных почв и микробиоты диких копытных животных.
Материал и методы исследований. Опыты in vivo по определению безопасности (токсигенность, вирулентность) штаммов B. subtilis , выделенных из мерзлотных почв и микробиоты диких копытных животных, проведены на лабораторных животных в лаборатории по разработке микробных препаратов Якутского научноисследовательского института сельского хозяйства им. М.Г. Сафронова, согласно «Методических рекомендаций по выделению и идентификации бактерий группы Bacillus subtilis-mesentericus из организма человека и животных» [7]. Исследованы 17 штаммов: B. subtilis -1р, B. subtilis -2р, B. subtilis -4р, B. subtilis -15, B. subtilis -11, B. subtilis -48, B. subtilis -24, B. subtilis -28, B. subtilis -4, B. subtilis -54, B. subtilis -36, B. subtilis -25, B. subtilis -16, B. subtilis -1, B. subtilis -27, B. subtilis -5. Молекулярно-генетическая идентификация штаммов проведена в центре коллективного пользования «ГЕНОМИКА» института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск).
Для изучения токсигенности штаммов B. subtilis выращивали в течение 5 суток на мясо-пептонном бульоне (МПБ) при температуре 37 °C. По истечении срока бульонную культуру центрифугировали при 5000 об/мин в течение 30 мин. Для введения мышам использовали надосадочную жидкость. Культуральную жидкость вводили в дозе по 0,5 мл на 1 голову подкожно. На каждый штамм использовали по 3 белые мыши. Контролем служила группа мышей, получавших стерильный МПБ в дозе по 0,5 мл.
Для определения вирулентности использованы штаммы бактерий B. subtilis после 24-часового роста на мясопептонном агаре. После смыва с агара готовили 5 млрд взвесь в физиологическом растворе. Суспензии вводили однократно внутрибрюшинно по 0,5 мл (5х109 КОЕ/мл) на голову. На каждый штамм использовали по 3 белые мыши. Животным контрольной группы вводили физиологический раствор в аналогичных объемах.
За подопытными животными вели наблюдение в течение 10 дней после проведения манипуляций, учитывая общее клиническое состояние: состояние шерстного покрова, поедаемость корма и потребление воды. Критерием оценки по тестам являлось отсутствие проявления симптомов интоксикации и гибели подопытных. Вели учет живой массы до и после опыта.
Математическую обработку полученных данных осуществляли с использованием прикладной программы Snedecor, Microsoft Excel. Результаты опытов подвергли также статистической обработке по методу Стьюдента.
Результат исследований. В результате проведенных исследований установлено, что все 17 штаммов В. subtilis, выделенные из мерзлотной почвы и кишечной микробиоты диких животных, не обладают токсигенностью и вирулентностью в испытанных концентрациях. Все животные оставались живыми в течение периода наблюдения (10 суток), ни у одного из них не выявлены признаки заболевания (Таблица 1).
В ходе экспериментов в течение 10 дней наблюдения состояние подопытных мышей оставалось удовлетворительным, животные были подвижны, реакция на внешние раздражители и потребляемость пищевых рационов оставались такими же, как и до введения суспензий и супернатантов B. subtilis. Изменения состояния шерстного покрова, а также проявления других симптомов интоксикации отсутствовали. Коэффициент достоверности по Стьюденту у каждой исследованной группы мышей из трех белых лабораторных мышей составил P>0,05.
Таблица 1 – Результаты изучения безопасности штаммов В. subtilis, выделенных от диких копытных животных
|
№ п/п |
о 2 л 5 2 b 5 С св Л н е а к |
оа « а S <и S о В и К ч ° о « |
св * ё § о 8 Ч и св 2 |
Токсигенность (п/к по 0,5 мл/гол) |
Вирулентность (в/б по 0,5 мл/гол) |
х а 2 § а ч а ^ 2 |
Св' Св нЧ о св Оч О О 8 2 |
||||
|
8 В & 2 о Ч св 6 |
о о ко |
к |
S & 2 о Ч св S |
о о со |
к |
||||||
|
1 |
B. subtilis 1р |
3 |
25,8±1,64 |
5 |
0 |
0 |
5 |
0 |
0 |
3 |
27,7±1,43 |
|
2 |
B. subtilis 2р |
3 |
23,4±1,43 |
5 |
0 |
0 |
5 |
0 |
0 |
3 |
26,5±1,66* |
|
3 |
B. subtilis 4р |
3 |
24,1±1,26 |
5 |
0 |
0 |
5 |
0 |
0 |
3 |
25,0±1,26 |
|
4 |
B. subtilis 15 |
3 |
24,4±1,26 |
5 |
0 |
0 |
5 |
0 |
0 |
3 |
27,9±1,15* |
|
5 |
B. subtilis 11 |
3 |
34,0±0,1 |
5 |
0 |
0 |
5 |
0 |
0 |
3 |
31,9±1,15 |
|
6 |
B. subtilis 48 |
3 |
24,0±1,52 |
5 |
0 |
0 |
5 |
0 |
0 |
3 |
24,7±1,99* |
|
7 |
B. subtilis 5 |
3 |
32,0±0,1 |
5 |
0 |
0 |
5 |
0 |
0 |
3 |
32,0±1,26 |
|
8 |
B. subtilis 24 |
3 |
28,2±1,20 |
5 |
0 |
0 |
5 |
0 |
0 |
3 |
28,8±1,43* |
|
9 |
B. subtilis 28 |
3 |
28,1±1,15 |
5 |
0 |
0 |
5 |
0 |
0 |
3 |
29,4±1,60* |
|
10 |
B. subtilis 4 |
3 |
24,4±1,43 |
5 |
0 |
0 |
5 |
0 |
0 |
3 |
27,5±0,1* |
|
11 |
B. subtilis 54 |
3 |
23,6±1,52 |
5 |
0 |
0 |
5 |
0 |
0 |
3 |
23,1±1,25 |
|
12 |
B. subtilis 36 |
3 |
30,0±0,1 |
5 |
0 |
0 |
5 |
0 |
0 |
3 |
30,0±0,1 |
|
13 |
B. subtilis 25 |
3 |
27,5±0,1 |
5 |
0 |
0 |
5 |
0 |
0 |
3 |
29,3±1,20* |
|
14 |
B. subtilis 16 |
3 |
30,1±1,20 |
5 |
0 |
0 |
5 |
0 |
0 |
3 |
35,8±1,20** |
|
15 |
B. subtilis 1 |
3 |
29,6±1,52 |
5 |
0 |
0 |
5 |
0 |
0 |
3 |
21,3±1,15 |
|
16 |
B. subtilis 27 |
3 |
21,5±1,43 |
5 |
0 |
0 |
5 |
0 |
0 |
3 |
24,6±1,43* |
|
17 |
Контроль |
3 |
24,7±1,20 |
5 |
0 |
0 |
5 |
0 |
0 |
3 |
27,4±1,49* |
Примечание: *P >0,05, **Р <0,05
В настоящее время в России прослеживается острая необходимость замещения импортных товаров, в том числе лекарственных средств, ферментных и кормовых добавок. Так, большинство кормовых добавок с пробиотическими и ферментативными свойствами иностранного происхождения, поэтому поиск новых безопасных эффективных штаммов природного происхождения является актуальным для разработки биологических препаратов отечественного производства.
Полученные результаты сопоставимы с изучением токсичности при многократном внутрижелудочном введении препарата «Сахабактисубтил», разработанного на основе штаммов B. subtilis ТНП-3 и B. subtilis ТНП-5 , выделенных из мерзлотных почв крысам
CD (Sprague-Dawley) на протяжении 14 дней разным половозрастным группам и дозам, которые подтвердили безопасность использования и отсутствие токсичности [5]. Также согласуются с тем фактом, что штаммы B. subtilis являются безопасными при производстве пищевых продуктов и квалифицируются статусом презумпции безопасности (QPS) Европейского органа и (GRAS) "общепризнанно безопасная бактерия [10-11]".
Заключение. Таким образом, проведенные исследования показали, что все испытуемые 17 штаммов бактерий Bacillus subtilis , выделенные из мерзлотных почв и микробиоты диких копытных, в исследуемых дозах при однократном подкожном и внутрибрюшном введении не обладают токсигенными и вирулентными свойствами для лабораторных животных.
Полученные результаты позволяют заключить, что штаммы бактерий Bacillus subtilis, выделенные из природной среды Якутии, являются безопасными и могут быть в дальнейшем использованы при разработке биологических препаратов.
Резюме
Разработка и дальнейшее использование препаратов на бактериальной основе требует тщательных исследований безопасности действующего вещества и их компонентов. В статье представлены результаты исследования токсигенности и вирулентности 17-ти штаммов B. subtilis , выделенные из микробиоты диких копытных животных Республики Саха (Якутия).
Токсигенность проверена подкожным введением 0,5 мл супернатантов, вирулентность - внутрибрюшинным введением 0,5 мл суспензии с содержанием 5х109 КОЕ/мл исследуемых штаммов B. subtilis лабораторным животным. Для обеспечения объективности экспериментов суспензию и супернатант одного штамма вводили трем белым лабораторным мышам. Наблюдения за подопытными животными проводились в течение 10-ти дней, во время которых оценивали их общее физиологическое состояние, потребление пищи, увеличение живой массы, состояние шерсти. В ходе экспериментов состояние подопытных мышей оставалось удовлетворительным. Таким образом, 17 штаммов Bacillus subtilis , выделенные из кишечной микробиоты диких копытных животных, не обладают токсигенными и вирулентными свойствами по отношению к лабораторным животным и могут быть перспективными для разработки биологических препаратов.
Список литературы Оценка безопасности штаммов Bacillus subtilis, выделенных из природной среды Якутии
- Андрюков, Б. Г. Мобильные генетические элементы прокариот и их роль в формировании резистентности к антибиотикам у патогенных бактерий / Б. Г. Андрюков, Н. Н. Беседнова, Т. С. Запорожец // Антибиотики и химиотерапия. – 2022. – Т. 67. – № 1-2. – С. 62-74. – DOI: 10.37489/0235-2990-2022-67-1-2-62-74. – EDN YFPAUN.
- Донкова, Н. В. Ферментативная активность бактерий из рода bacillus при гидролизе крахмалсодержащего растительного сырья / Н. В. Донкова, С. А. Донков // Вестник КрасГАУ. – 2021. – № 5. – C. 174-179. – DOI: 10.36718/1819-4036-2021-5-174-179.
- Лайшев, К. А. Микробиота рубца у северных оленей (rangifer tarandus) с клиническими проявлениями некробактериозов / К.А. Лайшев, Л.А. Ильина, Е.А. Йылдырым, В.А. Филиппова // С.-х. биол., Сельхозбиология. – 2019. – № 4. – С. 744- 753. – DOI: 10.15389/agrobiology.2019.4.744rus.
- Неустроев, М. П. Определение максимальной толерантной дозы препарата Сахабактисубтил на мышах линии СД-1 / М. П. Неустроев, А. Н. Мурашев, Д. А. Бондаренко, А. М. Степанова, Н. П. Тарабукина // Российский журнал Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии. – 2020. – № 2(34). – С. 240-244. – DOI: 10.36871/vet.san.hyg.ecol.202002019. – EDN HYBGOT.
- Неустроев, М. П. Исследование токсичности препарата Сахабактисубтил на крысах / М.П. Неустроев, А. Н. Мурашев, Д. А. Бондаренко, A. М. Степанова, Н. П. Тарабукина // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2017. – № 5. – С. 59-64.
- Савельев, С. Н. Получение рекомбинантного белка при помощи штамма bacillus subtilis szmc 6179j / С. Н. Савельев, Е. А. Руденская, И. С. Милентьева // Colloquium-journal. – 2020. – №11 (63). – DOI: 10.24411/2520-6990-2020-11727.
- Смирнов, В. В. Методические рекомендации по выделению и идентификации бактерий рода Bacillus из организма человека и животных / В. В. Смирнов, С. Р. Резник, И. Б. Сорокулова // Киев: Наукова думка. – 1983. – С. 51.
- Тарабукина, Н. П. Бактерицидная активность санитарно- гигиенического средства на основе штаммов бактерий bacillus subtilis / Н. П. Тарабукина, М. П. Неустроев, А. М. Степанова, С. И. Парникова, С. В. Дулова, М. П. Скрябина, Н. А. Обоева // Гигиена и санитария. – 2020. – № 3. – С. 265-269. – DOI: https://dx.doi.org/10.33029/0016-9900-2020-99-3-265-269
- Тремасова, А. М. Токсикологическая оценка консорциума микроорганизмов для использования с целью повышения качества кормов / А. М. Тремасова, И. И. Идиятов, Ю. М. Тремасов, А. И. Ерошин // Вестник Марийского государственного университета. Серия «Сельскохозяйственные науки. Экономические науки». – 2020. – №3. – С. 318-324. – DOI: 10.30914/2411-9687-2020-6-3-318-324.
- Yao, D. Enhanced extracellular expression of Bacillus stearothermophilus α- amylase in Bacillus subtilis through signal peptide optimization, chaperone overexpression and α-amylase mutant selection / D. Yao, L. Su, N. Li, J. Wu // Microb Cell Fact. – 2019. – Vol. 18. Issue 69. ISSN: 1475-2859. – DOI: https://doi.org/10.1186/s12934-019-1119-8.
- Zhang, Y. Enhancement of pullulanase production from recombinant Bacillus subtilis by optimization of feeding strategy and fermentation conditions / Y. Zhang, Y. Nie, X. Zhou, J. Bi, Y. Xu // AMB Express. – 2020. – Vol. 10. Issue 11. – DOI: 10.1186/s13568-020-0948-5.
