Оценка биодоступности флавоноидов с помощью теста «растворение»

Введение. В последнее десятилетие большое внимание уделяется вопросам применения больших объемов органических отходов (биомассы), достигающих до 140 млрд тонн в год, образующихся в результате деятельности сельскохозяйственной и пищевой промышленности [1–3]. Их утилизация оказывает негативное воздействие на окружающую среду [4]. В то же время значительная часть биомассы может являться легкодоступным недорогим источником для извлечения соединений повышенной ценности [5], которые обладают широким спектром биологической активности. Среди них заметная роль принадлежит флавоноидам, обладающим разнообразной биологической активностью (антиоксидантной, противовоспалительной, анти-аллергенной, противовирусной, противораковой, антимикробной, антимутагенной, кардио-защитной и др.) [6–8] и широко представленным в растительном сырье Алтайского края. Наличие этих свойств побуждает к использованию природных фенольных соединений как в качестве пищевых добавок [9–12], так и в качестве добавок для изменения функциональных характеристик материалов, которые затем могут использоваться в биомедицине [13–15], косметической [16–19] или пищевой [20–24] промышленности.

В современной науке огромное внимание уделяется поиску оптимальных путей использования флавоноидов в целях укрепления здоровья людей, профилактики и лечения различных патологий. Однако растительные флавоноиды (рутин, кверцетин, дигидрокверцетин) относятся к IV классу веществ по показателю растворимости по критериям «проницаемость стенок ЖКТ – растворимость» [25]. Соединения данного класса имеют низкую биодоступность и плохо поглощаются слизистой оболочкой кишечника.

Следует отметить, что внимание многих исследований последних лет сконцентрировано на повышении биодоступности полифенольных веществ, в том числе флавоноидов, в организме человека [26]. Так, известно, что около 5–10 % полифенолов всасывается в тонком кишечнике, в то время как 90–95 % всех полифенолов достигают области толстой кишки в неабсорбиро-ванной форме и для достижения желаемого терапевтического эффекта полифенолов в кишечнике потребуется эффективная система доставки [27]. Таким образом, флавоноиды должны быть максимально биодоступными для обеспечения ожидаемого терапевтического эффекта [28], что достигается различными способами: липосомирование [29], микронизация [30], инкапсуляция в наноэмульсионную систему [30] и другие физические, химические и физикохимические способы микрокапсулирования. Несмотря на то что микрокапсулирование биологически активных соединений применяется несколько десятилетий, на сегодня оно остается актуальной и быстроразвивающейся технологией не только в фармацевтической, но и пищевой промышленности, позволяющей защищать и доставлять биологически активные соединения к физиологическим целям без потери ими биологической активности [31].

Оценка биодоступности биологически активных веществ проводится различными методами, среди которых выделяют:

• -    модельные опыты in vitro , основанные на физико-химических и микробиологических исследованиях;

• -    биологические методы in vivo , проводимые на живых организмах (животные, люди-добровольцы) или изолированных органах.

В опытах in vivo определяют содержание вещества или метаболитов в крови или интенсивность выделений их из организма животных. В методах in vitro проводится оценка растворения вещества в модельных средах, имитирующих биологическую жидкую среду (желудочный сок, кишечный сок), в течение определенного промежутка времени. Для этих методов характерны точность, воспроизводимость и экономия во времени. Одним их таких методов является тест «Растворение» [32].

Цель исследования – сравнительное исследование биологической доступности флавоноидов (на примере рутина фармакопейного качества и рутина микрокапсулированного) в опытах in vitro .

Объекты и методы. Объектами исследования являлись:

• -    рутин фармакопейного качества – [руто-зид, кверцетин-3-О-рутинозид], (2-(3,4-дигидро-ксифинил)-5,7-дигидрокси-3-[α-L-рамнопирано-зил-(1→6)-β-D-глю-копиранозилокси]-4Hхромен-4-он).     Молекулярная     формула     –

C27H30O16.3H2O. Субстанция рутина представляет собой зеленовато-желтый кристаллический порошок без запаха. Производитель – Biochem (Франция);

• -    микрокапсулированный рутин, полученный из порошка рутина фармакопейного качества методом распылительной сушки.

В ходе работы использованы следующие методы.

Метод распылительной сушки. Данный метод является одним из наиболее доступных методов микрокапсулирования, при котором вещество предварительно растворяют в подходящем растворителе и гомогенизируют, затем распыляют с помощью распылительной сушилки, при этом происходит испарение воды и опускание на дно резервуара высушенных микрокапсул [33]. В качестве защитного вещества для микрокапсулирования рутина использовался мальтодекстрин.

Тест «Растворение» используется для определения концентрации флавоноидов (на примере рутина и рутина микрокапсулированного) в модельных средах желудочного и кишечного сока. Проводился в соответствии с ОФС.1.4.2. 0014.15 «Растворение для твердых дозированных лекарственных форм» [34]. Испытание «Растворение» предназначено для определения количества действующего вещества, которое при определенных условиях за определенный промежуток времени должно высвобождаться в среду растворения.

Выбор среды растворения является критическим при разработке теста. При приготовлении модельных сред желудочного и кишечного сока с заданными значениями pH среды руководствовались ОФС.1.3.0003.15 «Буферные растворы» [35].

В качестве модельных сред растворения определены следующие среды.

С моделированная желудочная жидкость (pH=2) приготовлена растворением 0,2 г NaCl и 0,7 мл HCl в дистиллированной воде с добавлением 0,023 г пепсина натурального акт. 28000 ед/г и разведением дистиллированной водой до 100 мл.

Смоделированная кишечная жидкость приготовлена растворением 0,68 г KH 2 PO 4 (дигидрофосфата калия) и 19 мл 0,2 моль/литр NaOH в дистиллированной воде с добавлением 0,641 г пепсина акт. 54600 ед/г и разведением дистиллированной водой до 100 мл.

Отобранную аликвотную часть раствора анализировали по методу Фолина-Чокальтеу для определения полифенольных соединений.

Для анализа содержания флавоноидов (рутина и рутина микрокапсулированного) в растворах применялся спектрофотометрический метод исследования растворов. Данный метод основан на определении оптической плотности раствора анализируемых веществ при определенной длине волны. Для проведения исследования использован спектрофотометр Shimadzu UV-1800.

Результаты и их обсуждение. Согласно методике по ОФС.1.4.2.0014.15, испытание проводили в две стадии: кислотная и щелочная. На кислотной стадии проводилось определение содержания действующего вещества в модельной среде желудочного сока (кислая среда pH=2). На щелочной стадии проводилось определение содержания действующего вещества в модельной среде кишечного сока (щелочная среда с pH=7,7).

Температура среды растворения доводилась до 37±0,5 °С в термостате суховоздушном ТС-1/80 СПУ, что соответствует температуре жидкости организма человека, и была одинакова на протяжении всего эксперимента.

Для обеспечения условий эксперимента, близких к естественным, проведения теста использовался шейкер возвратно-поступательный LOIP LS-120.

Время отбора проб составляло для модельной среды желудочного сока каждые 10 минут на протяжении 120 минут; для модельной среды кишечного сока каждые 2 минуты на протяжении 20 минут. Отбор проб проводился из средней зоны емкости со средой растворения, так чтобы расстояние до стенок емкости было не менее 1 см. При заборе каждой пробы перемешивали среду растворения, чтобы приблизить состав к однородности.

Отобранную аликвотную часть раствора анализировали по методу Фолина-Чокальтеу. Для этого в пробирке смешивали 1,0 мл водного раствора реактива Фолина-Чокальтеу, добавляли 1,0 мл пробы и 10,0 мл раствора карбоната натрия, доводили объем раствора до 100 мл дистиллированной водой, тщательно перемешивали.

После выдерживания полученных растворов в течение 30 мин при комнатной температуре с помощью спектрофотометра Shimadzu UV-1800 измеряли их оптическую плотность при 630 нм. Контрольным образцом для проведения спектрофотометрического анализа содержания флавоноидов в растворе явилась вода дистиллированная.

Таким образом, проведение эксперимента предусматривало следующие этапы:

• 1)    подготовка среды растворения (модельные среды желудочного (pH=2) и кишечного сока (pH=7,7) с температурой жидкости 37±0,5 °С);

• 2)    растворение действующего вещества (порошка рутина фармакопейного качества или микрокапсулированного рутина);

• 3)    создание условий для проведения эксперимента, близких к естественным (поддержание температуры на уровне 37±0,5 °С и создание колебательных движений);

• 4)    отбор проб с определенными интервалами времени в заданном периоде (120 мин для модельной среды желудочного сока и 20 мин для модельной среды кишечного сока);

• 5)    анализ отобранных частей раствора по методу Фолина-Чокальтеу с выдерживанием в течение 30 мин при комнатной температуре;

• 6)    определение плотности растворов спектрофотометрическим методом;

• 7)    обработка результатов исследования.

Результаты теста «Растворение» в модельных средах желудочного и кишечного сока представлены в таблицах 1 и 2.

Результаты теста «Растворение» в модельной среде желудочного сока (n = 5, M±m)

Таблица 1

Номер пробы	Рутин фармакоп.	Рутин микрокапс.
1	2	3
1	26,934±3,2	25,915±3,2
2	32,919±3,2	23,280±3,2
3	56,306±3,2	13,636±3,2
4	77,699±3,2	34,551±3,2
5	71,981±3,2	32,263±3,2
6	62,370±3,2	42,866±3,2
7	59,822±3,2	43,382±3,2

Окончание табл. 1

1	2	3
8	67,882±3,2	43,897±3,2
9	55,151±3,2	51,970±3,2
10	62,035±3,2	53,134±3,2
11	66,506±3,2	75,391±3,2
12	73,204±3,2	64,430±3,2
Среднее значение	59,401±3,2	42,060±3,2

Анализ растворимости микрокапсулированного рутина в модельной среде желудочного сока чившись, наблюдалась через 110 мин растворения и составила 75,391 мг/л. Микрокапсулирование рутина позволило сдержать его растворимость на протяжении 30–40 мин достаточно низкой. Только на шестой пробе (60 мин от начала эксперимента) концентрация микрокапсулированного рутина начала заметно расти, составив через 60 мин 42,866 мг/л. Кроме того, за 120 мин среднее значение концентрации рутина микрокапсулированного составило 42,060 мг/л, что позволяет судить о меньшем высвобождении рутина микрокапсулированного в желудочной жидкости по сравнению с субстанцией рутина фармакопейного качества. Результаты теста «Растворение» в модельной среде желудочного сока позволяют судить о том, что микрокапсулирование позволяет добиться пролонгированного действия активных веществ, обеспечивая их адресную доставку к отдельным органам и клеткам- показал, что максимальная концентрация веще-  мишеням.

ства в модели желудочного сока, резко увели-

Результаты теста «Растворение» в модельной среде кишечного сока (n = 5, M±m)

Таблица 2

Номер пробы	Рутин фармакоп.	Рутин микрокапс.
1	40,361±3,2	76,717±3,2
2	44,468±3,2	76,696±3,2
3	52,713±3,2	75,871±3,2
4	51,153±3,2	93,833±3,2
5	52,259±3,2	85,615±3,2
6	55,695±3,2	96,017±3,2
7	41,646±3,2	89,845±3,2
8	62,752±3,2	80,270±3,2
9	67,691±3,2	115,151±3,2
10	81,565±3,2	111,892±3,2
Среднее значение	55,030±3,2	90,191±3,2

Согласно данным таблицы 2, в модельной среде кишечного сока концентрация субстанции рутина фармакопейного качества постепенно нарастала со значения 40,361 через 2 минуты эксперимента и к концу эксперимента (через 20 минут) достигла максимального значения 81,565 мг/л. Среднее значение концентрации рутина в модельной среде кишечного сока составило 55,030 мг/л.

Концентрация рутина микрокапсулированного также постепенно нарастала со значения 76,716 мг/л через 2 мин от начала эксперимента, достигнув максимума на 18-й минуте (115,151 мг/л). Среднее значение концентрации рутина микрокапсулированного в модельной среде кишечного сока составило 90,191 мг/л, что значительно выше аналогичного показателя при растворении порошка рутина.

Заключение. Проведенное исследование показало, что субстанция рутина фармакопейного качества начинает быстро растворяться уже через 30-40 мин пребывания в желудочном соке, достигая концентрации с 26,934±3,2 мг/л в начале эксперимента до 77,699±3,2 мг/л в промежутке 30–40 мин, тем самым подвергаясь негативному воздействию кислотной среды. При этом в тонком кишечнике, где обычно происходит наиболее интенсивное всасывание флавоноидов, показатели концентрации рутина становятся ниже (среднее значение концентрации рутина в модельной среде кишечного сока 55,030±3,2 мг/л, а в среде желудочного сока – 59,401±3,2 мг/л). Чем меньше концентрация вещества, тем ниже ее биодоступность, тем меньше возможность всасывания необходимого вещества и получения терапевтического эффекта.

Обратная картина наблюдалась с растворением микрокапсулированного рутина, концентрации которого в модельной среде желудочного сока не достигали высоких значений, при этом постепенно повышаясь только через 110 мин пребывания в кислой среде, достигнув концентрации от 25,915±3,2 в начале эксперимента до 75,391±3,2 мг/л только через 110 мин проведения эксперимента. В модельной среде кишечного сока концентрации рутина микрокапсулированного были высокими на протяжении 20 мин, обеспечивая его более высокую биодоступность (среднее значение концентрации в модельной среде кишечного сока составило 90,191±3,2 мг/л).

Таким образом, микрокапсулирование рутина позволило добиться пролонгированного действия вещества, обеспечив его сохранение в кислой желудочной среде и достаточно высокое высвобождение в среде кишечного сока, где происходит максимальное всасывание питательных веществ эпителием кишечника. Поэтому можно сделать вывод, что микрокапсулирование повышает биологическую доступность флавоноидов, в частности рутина, обладающих биологической активностью и оказывающих благоприятное воздействие на организм человека.