Оценка бионакопления и токсического действия наночастиц кобальт (II) алюмината для задач обеспечения гигиенической безопасности

Землянова Марина Александровна – доктор медицинских наук, главный научный сотрудник, заведующий отделом биохимических и цитогенетических методов диагностики; доцент кафедры микробиологии и иммунологии (e-mail: ; тел.: 8 (342) 236-39-30; ORCID: .

Степанков Марк Сергеевич – младший научный сотрудник лаборатории биохимической и наносенсорной диагностики (e-mail: ; тел: 8 (342) 237-18-15; ORCID: .

Пустовалова Ольга Васильевна – старший научный сотрудник лаборатории биохимической и наносенсорной диагностики (e-mail: ; тел: 8 (342) 237-18-15; ORCID: .

Недошитова Анна Владимировна – старший научный сотрудник лаборатории методов элементного анализа (e-mail: ; тел.: 8 (342) 237-10-37; ORCID: .

основе результатов экспериментальных исследований, направленных на изучение и оценку особенностей бионакопления и токсического действия материалов.

Типичным примером нового материала являются наноразмерные оксиды со структурой шпинели, такие как сплав Al 2 O 3 и СоО в виде наночастиц кобальт (II) алюмината (НЧ CoAl 2 O 4 ). НЧ CoAl 2 O 4 применяют в качестве пигмента в различных производственных сферах; катализатора – в химической промышленности; компонента микроэлектроники и строительных материалов; в процессах литья в металлургии¹ [1, 2]. В настоящее время активно ведутся исследования по возможности применения НЧ CoAl₂O₄ в пищевой промышленности в качестве подложки для иммобилизации инулиназы при производстве сахара путем гидролиза инулина [3], а также катализатора в процессах синтеза биотоплива [4].

Широкий спектр применения в различных отраслях и перспектива использования в пищевой промышленности обусловливает повышение риска экспозиции населения НЧ CoAl 2 O 4 , в том числе при употреблении продуктов питания. Согласно данным, представленным в научной литературе, и результатам собственных экспериментальных исследований установлено, что при пероральной экспозиции изолированные НЧ Al 2 O 3 и СоО благодаря малому размеру, относительно микрочастиц (МЧ) химических аналогов, в большей степени преодолевают энтерогематический барьер и накапливаются в органах-мишенях [5, 6]. Благодаря большей степени бионакопления и высокой реакционной способности данные НЧ вызывают развитие более выраженных негативных эффектов. Результаты данных исследований позволили предположить, что сплав веществ в виде НЧ CoAl₂O₄ может обладать большим потенциалом токсического действия, по сравнению с мик-роразмерным химическим аналогом. Вышесказанное подтверждает необходимость проведения экспериментальных исследований по установлению ключевых, отличных от МЧ, особенностей токсикокине-тики и токсикодинамики НЧ CoAl 2 O 4 для повышения точности и объективности регламентирования содержания в объектах окружающей среды.

Цель исследования – оценка ключевых особенностей бионакопления и токсического действия НЧ CoAl₂O₄ при многократной пероральной экспозиции.

Материалы и методы. Для выполнения экспериментов в качестве наноматериала использовали порошок НЧ CoAl₂O₄, синтезированный на базе АО «Гиредмет» (Россия) по заказу ФБУН «ФНЦ медикопрофилактических технологий управления рисками здоровью населения». НЧ синтезированы золь-гель методом из кобальта (II) азотнокислого 6-водного (Co(NO 3 ) 2 •6H 2 O) и алюминия азотнокислого 9-водно-го (Al(NO 3 ) 3 •9H 2 O). В качестве микроразмерного химического аналога использовали коммерческий порошок МЧ производства ООО «Химкрафт» (Россия).

Для подтверждения химического состава и принадлежности синтезированного материала к продукции наноиндустрии проводили сравнительную оценку физико-химических свойств с таковыми МЧ. Химический состав компонентов сплава определяли методом рентгеноспектрального микрозон-дового анализа; размер частиц – методом анализа изображений, полученных с помощью растровой электронной микроскопии; удельную площадь поверхности – методическими подходами, предложенными Брунауэром, Эмметом и Теллером.

Экспериментальные исследования выполняли на самках крыс линии Wistar средней массой 244,4 ± 7,6 г. Все манипуляции с экспериментальными животными осуществляли в соответствии с требованиями Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных или в иных научных целях (ETS № 123). Проведение исследования одобрено решением этического комитета Федерального научного центра медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения. Перед экспериментами все крысы адаптировались к условиям содержания в течение 14 суток.

Для определения начальной дозы тестируемых материалов при многократной пероральной экспозиции устанавливали значение среднесмертельной дозы (ЛД50) при однократном введении. Для этого выполнили эксперимент по моделированию острой пероральной экспозиции в соответствии с ГОСТ 32644-20142. Сформировали три группы по шесть крыс (для экспозиции НЧ, МЧ и контрольную группу). НЧ и МЧ CoAl2O4 вводили в дозе 2000 мг/кг массы тела в виде суспензии на основе бидистилли-рованной воды в объеме 1 см3 однократно через зонд из нержавеющей стали. После экспозиции в течение 14 суток наблюдали за животными для оценки дина- мики гибели. По результатам выживаемости значение ЛД50 составило > 2000 мг/кг массы тела.

Для выполнения эксперимента по изучению многократной пероральной экспозиции формировали три группы по 10 крыс аналогично вышеописанному опыту. Экспозиции проводили ежедневно в соответствии с МУ 1.2.2520-09³ по методике, предложенной Лимом с соавт. Длительность воздействия составила 20 суток, начальная доза – 1/10 (200 мг/кг массы тела) от установленной ЛД 50 . Повышение дозы осуществляли каждые четыре дня в 1,5 раза относительно предыдущей. Таким образом, суммарная доза НЧ и МЧ, полученная животными, составила 10 550 мг/кг массы тела.

Через 24 ч после последнего введения тестируемых веществ у крыс отбирали образцы крови для изучения биохимического и гематологического статусов; органы – для определения концентраций алюминия и кобальта и идентификации патоморфо-логических нарушений тканей.

Статистические различия показателей биораспределения, бионакопления, биохимического и гематологического статусов крови выявляли по методике Манна – Уитни с расчетом U -критерия с помощью программы Statistica 10. Статистически значимыми считали результаты при соответствии значению р ≤ 0,05.

Значение ориентировочно-допустимых уровней (ОДУ) содержания для НЧ и МЧ CoAl 2 O 4 в питьевой воде рассчитывали по токсикологическому признаку вредности в соответствии с МУ 2.1.5.720-98⁴.

Результаты и их обсуждение. Сравнительный анализ химического состава тестируемых образцов подтвердил наличие кобальта, алюминия и кислорода без посторонних примесей, что соответствует заявленной производителем химической формуле вещества (рис. 1).

Изучение физических свойств позволило установить в нанопорошке наличие частиц нанометрового диапазона (1–100 нм, 78,25 % от общего количества частиц), отсутствующих в составе микропорошка. НЧ в сравнении с МЧ обладают меньшим в 87,11 раза средним размером (52,12 / 4540 нм) и большей в 1,74 раза удельной площадью поверхности (14,51 / 8,33 м2/г). Изображения НЧ и МЧ, полученные методом РЭМ, представлены на рис. 2.

Биораспределение НЧ CoAl 2 O 4 при многократной пероральной экспозиции установлено в сердце, легких, печени, почках, головном мозге и крови экспонированных крыс. Суммарная концентрация алюминия и кобальта возрастает в 1,57–242,69 раза ( р = 0,002) относительно контрольных данных. При экспозиции МЧ суммарная концентрация исследуемых элементов в данном перечне органов и крови повышается в 1,94–32,20 раза ( р = 0,002) относительно контрольных данных.

Сопоставление полученных результатов позволило установить более выраженную степень бионакопления НЧ CoAl₂O₄ относительно микроразмерно-го химического аналога по увеличению суммарной концентрации алюминия и кобальта в сердце, легких, печени и почках в 2,66 ( р = 0,014), 7,54 ( р = 0,001), 1,29 ( р = 0,001) и 2,06 раза ( р = 0,001) соответственно. Результаты исследования биораспределения и бионакопления представлены на рис. 3.

Рис. 1. Рентгенограмма образцов сплава CoAl₂O₄: а – нанодисперсный; б – микродисперсный

Рис. 2. Изображение частиц сплава CoAl₂O₄ с помощью РЭМ: а – нанопорошок; б – микропорошок

Рис. 3. Суммарная концентрация алюминия и кобальта в органах и тканях ( р ≤ 0,05): * – статистически значимое отличие от контрольной группы, ^ – от экспозиции МЧ

Установлено изменение биохимических показателей крови крыс, экспонированных НЧ CoAl2O4, в виде увеличения активности аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (АСТ), гамма-глютамилтранспептидазы (γ-ГТ), амилазы, лактатдегидрогеназы (ЛДГ), концентраций креатинина, С-реактивного белка (СРБ) и малонового диальдегида (МДА) в 1,30–6,23 раза (р = 0,002) и уменьшения общей антиоксидантной активности (АОА) в 1,99 раза (р = 0,005) относительно контрольных данных. Воздействие микроразмерного химического аналога вы- зывает увеличение активности АЛТ, АСТ, γ-ГТ, амилазы, ЛДГ и концентрации креатинина в 1,24–6,30 раза (р = 0,002–0,012) и уменьшение АОА в 2,31 раза (р = 0,002) в сравнении с значениями показателей в крови крыс контрольной группы. Сравнительный анализ биохимических показателей показал более высокие значения активности АЛТ, АСТ, амилазы, ЛДГ и концентрации МДА в 1,37–2,25 раза (р = 0,001–0,014) при экспозиции НЧ относительно МЧ. Результаты исследования биохимических показателей крови крыс представлены на рис. 4.

Изменение гематологических показателей крови крыс при экспозиции НЧ характеризуется снижением количества тромбоцитов, тромбокри-та, количества крупных тромбоцитов в 3,57–5,98 раза ( р = 0,002) относительно контрольных значений. При экспозиции МЧ значение данных показателей уменьшается в 1,66–1,79 раза ( р = 0,045). Отличительной особенностью эффекта, оказываемого НЧ на гематологические показатели крови, является меньшее количество тромбоцитов, тром-бокрит, содержание крупных тромбоцитов в 2,00– 3,60 раза ( р = 0,001–0,014). Результаты исследования гематологических показателей крови крыс представлены на рис. 5.

При гистологическом исследовании тканей органов крыс, экспонированных НЧ и МЧ, в легких установлено развитие патоморфологических изменений в виде очаговой интерстициальной пневмонии, бронхита, васкулита, полнокровия; в печени идентифицировано острое венозное полнокровие. Отличительной особенностью воздействия НЧ являются геморрагические инфаркты и отек легких, не установленные при экспозиции микроразмерным химическим аналогом (рис. 6). В тканях сердца, почек и головного мозга не установлено патоморфологических изменений.

Согласно расчету ОДУ содержания НЧ CoAl 2 O 4 в питьевой воде по токсикологическому признаку вредности составил 0,02 мг/дм³, МЧ – 0,2 мг/дм³.

Рис. 4. Биохимические показатели крови крыс ( р ≤ 0,05):

* – статистически значимое отличие от контрольной группы, ^ – от экспозиции МЧ

Рис. 5. Гематологические показатели крови крыс ( р ≤ 0,05):

* – статистически значимое отличие от контрольной группы, ^ – от экспозиции МЧ

а

б

Рис. 6. Микрофотографии гистологических препаратов легких ( а ) и печени ( б ) крыс, окраска гематоксилином и эозином, увеличение 200х: 1 – экспозиция НЧ; 2 – экспозиция МЧ; 3 – контрольная группа

Аналитическое обобщение результатов проведенных исследований показало, что физические свойства НЧ тестируемого порошка CoAl 2 O 4 существенно отличаются (до 87,11 раза) по показателю размера и удельной площади поверхности от микро-размерного химического аналога. Это позволяет предположить способность исследуемого наноматериала накапливаться в органах-мишенях в большем количестве и вызывать более выраженные морфофункциональные нарушения [7, 8].

Как НЧ CoAl2O4, так и МЧ способны преодолевать энтерогематический барьер. В подтверждение этого установлено увеличение суммарной концентрации кобальта и алюминия в крови экспонированных крыс (~до 2 раз относительно контрольных значений). С током крови НЧ и МЧ распространяются по организму, распределяясь преимущественно в сердце, легких, печени, почках и головном мозге (суммарная концентрация НЧ превышает контрольные уровни до 242,69 раза; МЧ – до 32,20 раза). НЧ обладают более выраженным бионакоплением (до 7,54 раза) в сердце, легких, печени и почках по сравнению с микроразмерным химическим аналогом.

В научной литературе практически отсутствуют данные о механизме развития негативных эффектов, ассоциированных с экспозицией НЧ CoAl 2 O 4 . Однако в исследованиях in vitro и in vivo установлена способность изолированных НЧ Al 2 O 3 и СоО усиливать генерацию свободных радикалов, приводящих к развитию окислительного стресса [10–14]. Результаты выполненного исследования подтверждают данный механизм при воздействии сплава указанных химических соединений. Воздействие НЧ CoAl 2 O 4 приводит к усилению окислительных реакций и угнетению восстановительного процесса, отмеченным по увеличению активности МДА и снижению АОА (~до 2 раз относительно контрольных данных). Дисбаланс между реакциями окисления и восстановительными процессами более выражен при экспозиции наноматериалом относительно микроматериала (~в 1,4 раза), что может привести к более выраженной цитотоксичности [15].

На развитие цитотоксического эффекта указывает увеличение цитолитической активности по повышению активности ЛДГ, АЛТ и АСТ (до 3,38 раза относительно контрольных данных) при экспозиции

НЧ и МЧ. Изменения, вызываемые НЧ, более выражены (до 1,85 раза), что подтверждает большую цитотоксичность относительно микроматериала. Одним из характерных проявлений цитотоксического эффекта различных наноразмерных оксидов металлов является изменение проницаемости клеточной мембраны [16]. Установленное повышение активности в крови таких ферментов, как АЛТ, АСТ и γ-ГТ, в норме локализующихся в клетках печени, может указывать на увеличение проницаемости мембраны гепатоцитов и, как следствие, нарушение функций органа [17–20]. Изменение показателей, связанных с гепато-токсическим эффектом, вызываемое НЧ CoAl 2 O 4 , более выражено (до 1,58 раза) в сравнении с влиянием, оказываемым МЧ. В результате нарушения функций печени может снизиться синтез тромбопоэтина, регулирующего формирование тромбоцитов [21]. В подтверждение этому в крови экспонированных крыс установлена тромбоцитопения по уменьшению количества тромбоцитов, тромбокрита и количества крупных тромбоцитов (при экспозиции НЧ ~ до 6 раз относительно контрольных данных, при экспозиции МЧ ~ до 2 раз). Снижение тромбоцитарных показателей более выражено при воздействии наноматериала (до 3,60 раза относительно эффекта МЧ). Снижение количества тромбоцитов в крови может негативно сказаться на ангиотрофическом, адгезивно-агрегационном, фибринолитическом процессах и иммунитете организма⁵.

Цитотоксический эффект, вызванный окислительно-восстановительным дисбалансом, может проявляться в виде воспалительного процесса, инициированного провоспалительными цитокинами, высвободившимися из клеток в результате окислительного повреждения свободными радикалами [22]. Развитие воспалительного процесса идентифицировано по увеличению содержания СРБ в крови крыс, экспонированных НЧ (в 1,30 раза относительно контрольных данных), в то время как воздействие МЧ не вызывает статистически значимого изменения показателя. В исследованиях [23–25] отмечена роль воспалительных изменений, ассоциированных с окислительным стрессом, в развитии нарушений функции поджелудочной железы и почек. Это согласуется с установленным увеличением активности амилазы и креатинина при экспозиции НЧ и МЧ (до 2,91 и 1,41 раза соответственно относительно контрольных значений). Эффект, оказываемый наноматериалом на функцию поджелудочной железы, более выражен в сравнении с воздействием МЧ (в 2,25 раза).

НЧ и МЧ CoAl2O4 вызывают негативные эффекты на тканево-органном уровне в виде воспаления и нарушения кровообращения. Экспозиция НЧ влечет за собой более выраженное нарушение кровообращения в легких, что отмечено по геморрагическим инфарктам и отеку, не наблюдаемых у крыс, экспонированных микроматериалом. Вероятно, это может быть связано с большей степенью цитотоксичности НЧ. Провоспали-тельные цитокины, высвобожденные из клеток под воздействием НЧ, способны увеличивать проницаемость эндотелия сосудов, в результате чего происходит экссудация крови в орган [26, 27]. Таким образом, с усилением цитотоксического эффекта становятся более выраженными процессы, способствующие развитию нарушения кровообращения.

В действующих санитарных правилах и нормах⁶ не установлено значение предельно допустимой концентрации или ОДУ содержания в питьевой воде как для НЧ, так и для МЧ сплава CoAl 2 O 4 . Расчетная величина ОДУ для микроматериала составила 0,2 мг/дм³. Принимая во внимание уникальные физические свойства и более выраженную степень токсичности НЧ относительно МЧ, полученное значение целесообразно сократить в 10 раз (0,02 мг/дм³).

Выводы. Согласно результатам выполненных исследований, НЧ CoAl 2 O 4 обладают меньшим размером (в 87,11 раза) и большей удельной площадью поверхности (в 1,74 раза) относительно микрораз-мерного химического аналога. За счет этого при пероральном поступлении в организм в течение 20 суток в суммарной дозе 10 550 мг/кг массы тела они обладают большей степенью бионакопления в сердце, легких, печени и почках (до 7,54 раза). Большая степень бионакопления НЧ обусловливает более выраженные негативные эффекты в виде усиления окислительного процесса (~ в 1,4 раза), цитотоксичности (до 1,85 раза), нарушения функции печени (до 1,58 раза) и поджелудочной железы (в 2,25 раза), тромбоцитопении (до 3,60 раза), воспалительного процесса (в 1,30 раза). НЧ вызывают более выраженные нарушения циркуляции крови в легких, представленные в виде геморрагических инфарктов и отека. Расчетная величина ОДУ содержания наноматериала в питьевой воде по токсикологическому признаку вредности составила 0,02 мг/дм³, что на порядок меньше, чем таковые величина у МЧ.

Полученные результаты позволяют повысить точность и объективность разработки гигиенических нормативов содержания НЧ CoAl 2 O 4 в пищевой продукции и питьевой воде для решения задач обеспечения гигиенической безопасности населения.

Финансирование. Исследование выполнено за счет федерального бюджета.