Оценка цитологической целостности и функциональной полноценности оттаянных сперматозоидов петухов (Gallus gallus domesticus L.) под воздействием антиоксидантных компонентов криозащитных сред инозитола и наночастиц оксида цинка (нч ZnO)

Повреждение сперматозоидов в цикле замораживания-оттаивания приводит к снижению функциональности и уменьшению получаемого потомства. Поэтому обеспечение сохранности цитологической целостности сперматозоидов - обязательное условие для практического использования криоконсервации в репродукции сельскохозяйственной птицы. В представленной работе впервые показано, что при использовании наночастицы ZnO (концентрация 50 мкг/100 мл) в составе криопротекторных сред для замораживания спермы петухов наночастицы могут оказывать контрацептивное действие и снижать функциональность оттаянных сперматозоидов, при этом доказано преимущество использования в составе криозащитных сред инозитола. Целью работы была оценка воздействия антиоксидантов естественного происхождение (инозитол) и/или наночастиц ZnO в составе криопротекторных сред на структурно-функциональное состояние заморожено-оттаянных сперматозоидов петухов. Исследования проводили в 2023 году на петухах (Gallus gallus domesticus L.) русской белой породы яичного направления продуктивности (n = 23) в возрасте 39-44 нед из биоресурсной коллекции Генетическая коллекция редких и исчезающих пород кур (ВНИИГРЖ, г. Санкт-Петербург). Отбор петухов по качеству семени проводили в соответствии с ГОСТ 27267-2017 (М., 2017). Объем эякулята (мл) измеряли градуированной пипеткой, концентрацию сперматозоидов (млрд/мл) - с использованием фотометра (Accuread Photometer, «IMV Technologies», Великобритания), общую подвижность (ОП, %) - на микроскопе Микромед МС-12 («Ningbo Sheng Heng Optics & Electronics Co Ltd.», Китай) при увеличении ×100. Полученные эякуляты объединяли и делили на 4 равные аликвоты (по числу разбавителей), затем разбавляли криопротекторными средами в соотношении 1:1. Использовали следующие криозащитные среды: ЛКС (контроль), Mal20, Mal20 + Inositol (содержание инозитола 11,25 ммоль), Mal20 + НЧ ZnO (размер наночастиц 14 нм; 50 мкг). Образцы замороженного семени хранили в сосудах Дьюара не менее 55 сут. Анализ общей и прогрессивной подвижности сперматозоидов проводили с помощью визуализирующей системы CASA АргусСофт-Poultry («АргусСофт», Россия). Жизнеспособность оценивали методом окрашивания красителем эозин-нигрозин (EN), визуализировали на фазово-контрастном микроскопе Motic BA410E («Motic», Китай) при увеличении ½1000. Определяли целостность акросом сперматозоидов нативного и заморожено-оттаянного семени. При оценке живых клеток и клеток в состоянии апоптоза использовали набор для проточной цитометрии V-AF488 (ООО «Люмипроб РУС», Россия). Для окрашивания активных митохондрий и измерения мембранного потенциала митохондрий в живых клетках использовали митохондриальный маркер Mito TMRE (тетраметилродамин, этиловый эфир; «Lumiprobe», Россия) на проточном цитометре Cytoflex («Beckman Coulter, Inc.», США). При определении содержания внутриклеточного АФК (H2O2) в живых сперматозоидах использовали набор для проточной цитометрии H2DCFDA (2',7'-дихлородигидрофлуоресцеин диацетат) (ООО «Люмипроб РУС», Россия). Интенсивность флуоресценции оттаянных сперматозоидов определяли с помощью платформы Flow Cytometry Analysis (https://floreada.io/). Фертильность заморожено-оттаянного семени оценивали с помощью искусственного осеменения кур. Формировали 3 группы кур (не менее 15 гол. в каждой), осеменяли 3 раза по схеме: 2 сут подряд и через 1 сут. Для осеменения использовали сперму, замороженную в средах ЛКС (контроль), Mal20 + Inositol, Mal20 + НЧ ZnO. Использование среды Mal20 + Inositol позволило повысить жизнеспособность оттаянных сперматозоидов на ~ 4 % (p 2O2 в оттаянных сперматозоидах, которые были заморожены в среде Mal20 + НЧ ZnO, оцененное по показателю медианного значения интенсивности флуоресценции (FI), было на 9,2 % меньше, чем у клеток, замороженных с ЛКС (контроль). Показатели оплодотворенности яиц после осеменения оттаянным семенем с НЧ ZnO были критически низкими 2,5-8,8 %, тогда как при использовании инозитола составляли 73,8-77,9 %, что было на ~ 10 % выше контроля. Таким образом, применение антиоксидантов различной природы в составе криопротекторных сред может оказывать неоднозначное влияние на сохранность субклеточных структур оттаянных сперматозоидов. Полученные результаты свидетельствуют о перспективности использования комбинации сахаридов (фруктоза и мальтоза) и полиола (инозитол) в составе криозащитных сред для семени петухов.