Оценка цитотоксических эффектов IgG, выделенных из сыворотки крови больных шизофренией

Шизофрения – мультифакториальное заболевание, этиологический и патогенетический механизмы которого остаются не изученными в полном объеме. Данные клинико-биологических исследований продемонстрировали важную роль иммунной системы в развитии шизофрении [1]. Многочисленные работы свидетельствуют об изменении концентрации цитокинов в периферической крови и спинно-мозговой жидкости, увеличении концентрации нейроспецифичных аутоантител у пациентов с шизофренией и активации микроглии [2, 3, 4, 5, 6]. В последние годы в сыворотке крови пациентов, страдающих шизофренией, обнаружены антитела, обладающие каталитическими свойствами (абзимы). К настоящему времени выявлены следующие абзимы: ДНК, РНК, ОБМ и гистон-гидролизующие и расщепляющие гидроперекись водорода иммуноглобулины класса G (IgG) [7, 8, 9]. Вместе с тем биологическая роль абзимов в патогенезе заболевания не изучена всесторонне и не установлена окончательно.

В опубликованных авторами из Австралии и США исследованиях обсуждается повышенная проницаемость гематоэнцефалического барьера при шизофрении [10, 11]. Однако до настоящего времени не установлен факт проникновения периферических иммуноглобулинов в головной мозг. Одна из известных патогенетических гипотез наделяет абзимы цитотоксическими свойствами, реализующимися на клетках головного мозга. Изучение молекулярных механизмов действия IgG, обладающих каталитическими свойствами, на клетки центральной нервной системы in vitro проверит эту гипотезу.

В настоящем исследовании в качестве экспериментальной модели для установления эффектов IgG использована иммортализованная клеточная линия глиального происхождения U87.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучение эффектов IgG, выделенных из сыворотки крови больных шизофренией, обладающих каталазной активностью, на жизнеспособность клеток на модели клеточной линии U87 глиобластомы человека.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Пациенты и материал

Работа выполнена на базе лаборатории молекулярной генетики и биохимии НИИ психического здоровья Томского НИМЦ. Больные шизофренией, включенные в исследование, получали лечение в отделении эндогенных расстройств (руководитель отделения ‒ д.м.н., профессор А.В Семке).

Диагностическая оценка и клиническая верификация заболевания были проведены врачами-психиатрами отделения эндогенных расстройств согласно МКБ-10 и руководству «Оценочный перечень симптомов и глоссарий для психических расстройств». В основную группу исследования были включены 13 пациентов в возрасте от 33 до 70 лет (средний возраст составлял 48,8±13,64 года) с диагнозом параноидной шизофрении (F20.00, F20.01, F20.02) в острой фазе; средняя длительность заболевания составила 18,08±11,5 года. Контрольную группу исследования составили 6 психически и соматически условно здоровых лиц. Средний возраст в контрольной группе составил 28,66±9,22 года.

Отбор условно здоровых проводился с использованием специально разработанной анкеты «Опросник здоровых лиц». Критерий включения – информированное добровольное согласие на участие в исследовании. Критерием исключения для всех участников исследования было наличие хронических инфекций, воспалительных и аутоиммунных заболеваний, а также острых вирусных или бактериальных инфекций не менее чем за 2 месяца до начала исследования.

Забор крови у пациентов осуществляли из локтевой вены утром натощак; использовали системы Vacutainer («Becton Dickinson», США) с активатором свертывания крови. Для отделения сыворотки от форменных элементов пробирку с кровью центрифугировали при 2000g в течение 20 минут при температуре +4°C в центрифуге Orto Alresa Digicen 21R (Испания).

Реактивы

В работе использовали среду Игла в модификации Дульбекко (ДМЕМ) (ООО НПП «ПанЭко», Россия), пенициллин/стрептомицин (ООО НПП «ПанЭко», Россия), инактивированную эмбриональную телячью сыворотку (Thermo Fisher Scientific, США), флуоресцентный краситель Hoechst (Thermo Fisher Scientific, США), флуоресцентный краситель Propidium Iodide (Thermo Fisher Scientific, США); буфер А (50 мM Трис-HCl, pH 7,5); буфер Б (0,1 М глицин-HCl, pH 2,6); 1М Трис-HCl, pH 8,8; 150 мM NaCl; Triton X-100.

Выделение IgG

IgG выделяли из сыворотки крови методом аффинной хроматографии на хроматографе AKTA purifier GE Healthcare. Для этого 1 мл сыворотки крови наносили на колонку с Protein-G Sepharose [8], уравновешенную буфером А (150 мМ NaCl, 50 мМ Tris-HCl, pH 7,5). Белки, не взаимодействующие с сорбентом, отмывали буфером А до полного исчезновения оптической плотности при значении λ 280 нм. Неспецифически связанные белки элюировали тем же буфером (3 мл), содержащим 1% Triton X-10,0 и промывали колонку буфером A до нулевой оптической плотности. Иммуноглобулины класса G элюировали буфером Б (0,1 М глицин-HCl, pH 2,6), элюат собирали в охлаждаемые пробирки, содержащие 1 М Tris-HCl (pH 8,8). Очищенные препараты IgG диализовали против 50 мМ Трис-HCl, pH 7,5, содержащего 150 мМ NaCl при +4°С в течение 17 часов. Концентрацию белка в полученных препаратах определяли с использованием спектрофотометра Epoch (BioTek, США). Гомогенность препаратов IgG была подтверждена методом градиентного электрофореза в 4-18% ПААГ.

Определение каталазной активности IgG [12]

Каталазную активность IgG определяли спектрофотометрическим методом на спектрофотометре Specord М40 (Германия) по снижению концентрации перекиси водорода при добавлении исследуемого образца IgG. В среду инкубации, содержащую перекись водорода в 50 мМ фосфатном буфере pH 7,0, добавляли 100 мкл IgG-антител (0,5 мг/мл) и регистрировали изменение оптической плотности при длине волны поглощения 240 нм в течение 5 минут.

При расчете активности каталазы исходили из значения коэффициента миллимолярной экстинкции перекиси водорода: ε=0,081 мМ-1/см-1.

Культивирование глиобластомы

Клетки глиобластомы человека U87 культивировали в среде ДМЕМ, содержащей 50 ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина и 10% эмбриональной телячьей сыворотки, при 37^o C, 90% влажности в атмосфере с 5% CO 2 в СО 2 -инкубаторе (Sanyo MCO-5AC, Япония). Смену среды проводили каждые 2-3 дня.

Для изучения эффектов IgG на показатели жизнеспособности клетки глиобластомы рассаживали в 96-луночные планшеты (1х104 клеток на лунку) и спустя сутки добавляли антитела IgG до конечной концентрации 0,2 мг/мл, далее культивировали в течение 72 часов. В качестве контроля использовали культуру, в которую вместо IgG вносили эквивалентные объемы буфера для диализа антител (50 мМ Трис-HCl, pH 7,5; 150 мМ NaCl). Указанные концентрации IgG-антител были подобраны с учетом результатов ранее проведенных собственных предварительных экспериментов и литературных данных [13, 14].

Оценка жизнеспособности клеток

Влияние препаратов IgG на жизнеспособность, оцениваемое на модели культуры клеток U87 глиобластомы человека, было проведено на платформе CellInsight CX7 HCS (Thermo Fisher Scientific, США), с использованием флуоресцентных красителей Hoechst (окрашивает все клеточные ядра, регистрация сигнала при значении длины волны 386 нм) и Propidium Iodide (окрашивает ядра мертвых клеток, регистрация сигнала на длине волны 560 нм). Далее ядра идентифицировали и анализировали на основе интенсивности флуоресценции сигнала с использованием программного обеспечения для анализа клеток HCS Studio ™ (Thermo Fisher Scientific).

Статистическая обработка результатов

Производилась с помощью программ SPSS, версия 20.0 для Windows. Проверку на нормальность распределения значений переменных проводили по критерию Колмогорова‒Смирнова. Статистическую значимость различий между независимыми группами, характеризующимися количественными признаками и не подчиняющимися нормальному закону распределения, оценивали с использованием непараметрического рангового критерия Краскела‒Уоллиса, для двух независимых групп – с помощью непараметрического критерия Манна‒Уитни. Корреляционный анализ проводили методом расчета коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Первым этапом работы являлось подтверждение принадлежности изучаемой активности IgG к выделенным иммуноглобулинам: выделение на специфическом аффинном сорбенте, определение электрофоретической гомогенности препаратов (рис. 1).

Рисунок 1. Электрофоретический анализ гомогенности препаратов IgG в градиентном ПААГ 4-18%

П р и м е ч а н и е: дорожки 1-8 – IgG, выделенные из крови исследуемых лиц; М – маркеры молекулярной массы белков, кДа.

Выделенные из сыворотки крови IgG использовали для изучения их собственной каталазной активности. Выявлено, что IgG больных шизофренией и условно здоровых доноров обладают каталазной активностью. При этом значения ак- тивности IgG пациентов статистически значимо (p=0,047) более высокие по сравнению со значениями в контрольной группе условно здоровых: 3,86 [2,41; 6,33] мМ Н2О2/мин/мг против 1,74 [1,18; 1,74] (рис. 2).

П р и м е ч а н и е. Уровень статистической значимости между группой больных шизофренией и контрольной группой условно здоровых лиц: * ‒ p=0,047.

На следующем этапе работы проводилось изучение влияния IgG c установленной каталазной активностью на показатели гибели клеток в клеточной культуре глиобластомы человека U87.

Долю мертвых клеток рассчитывали в соответствии с количеством ядер, окрашенных флуоресцентным красителем Propidium Iodide, от общего числа ядер (рис. 3).

а                                    б                                    в

Р и с у н о к 3. Регистрация клеток на приборе CX7

П р и м е ч а н и е. Клетки, окрашенные флуоресцентным красителем Hoechst – а; клетки, окрашенные флуоресцентным красителем Propidium Iodide – б; композиция двух красителей ‒ в.

В результате цитотоксический эффект препаратов IgG, полученных как из сыворотки крови больных шизофренией, так и условно здоровых лиц не был выявлен. Так, процент мертвых клеток после 72-часового воздействия IgG-антител, выделенных из крови пациентов, составил 1,78% [1,44; 2,15].

При добавлении в клеточную культуру IgG-антител условно здоровых лиц аналогичный показатель оказался более высоким и составил

2,03% [1,71; 2,24]. При культивировании глиобластомы с добавлением раствора Трис-HCl, но без IgG-антител процент мертвых клеток так же имел более высокое значение ‒ 2,01 [1,96; 2,07]. Однако статистически значимых (p=0,63) корреляционных взаимосвязей между показателями каталазной активности и процентом мертвых клеток не было обнаружено.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Ранее нами продемонстрировано, что IgG-антитела, выделенные из сыворотки крови больных шизофренией, обладают каталазной активностью [8]. В настоящей работе также определялась собственная каталазная активность IgG-антител, выделенных из сыворотки крови больных шизофренией и здоровых лиц. Подтверждены полученные ранее результаты и установлено, что каталазная активность IgG антител пациентов в стадии обострения клинических проявлений шизофрении статистически значимо превышает такую активность в группе здоровых людей. Этот результат можно связать с высоким уровнем генерализованного окислительного стресса у больных шизофренией [15, 16, 17, 18, 19, 20]. Показано, что антитела с каталитическими свойствами обнаружены при разных патологических состояниях и у здоровых лиц, но наибольшее число исследований посвящено свойствам абзимов при аутоиммунных заболеваниях [21]. При этом в ряде работ описаны цитотоксические эффекты препаратов IgG, проявляющих ДНК-азную активность, полученных из сыворотки крови больных системной красной волчанкой и ревматоидным артритом. Авторами высказываются предположения о способности IgG проникать через мембрану клеток, воздействуя на внутриклеточные процессы, активировать апоптоз и клеточную гибель [13, 22, 23].

В связи с этим на следующем этапе работы нами изучено влияние IgG, обладающих каталазной активностью, на жизнеспособность культуры клеток глиобластомы человека U87. Клеточную линию U87 широко применяют в научных исследованиях в качестве альтернативной модели глиальных клеток для изучения механизмов различных биологически активных соединений [24, 25]. Основными преимуществами использования им-мортализованных клеточных линий являются относительная простота при культивировании и высокая скорость роста клеток.

В результате проведенного in vitro эксперимента, вопреки предполагаемым ожиданиям, не было обнаружено цитотоксического эффекта препаратов IgG, выделенных из сыворотки крови больных шизофренией, на клеточной модели глиобластомы U87. Как известно, опухолевые клетки проявляют устойчивость к влиянию АФК и других цитотоксических факторов [26]. Возможно, отсутствие ожидаемого эффекта обусловлено наличием защитных механизмов, свойственных глиобластоме U87. Для окончательного вывода о влиянии IgG-антител больных шизофренией на показатели клеточной гибели необходимы дальнейшие исследования в этом направлении с использованием других клеточных моделей и методов исследования.