Оценка физико-химических характеристик семян с предпосевной обработкой биополимером

Сельское хозяйство сталкивается с существенными климатическими вызовами, среди которых нарастающая аридизация обширных территорий и увеличение частоты экстремальных засух занимают одно из центральных мест. Дефицит доступной почвенной влаги в сочетании с экстремальными высокими температурами оказывает негативное воздействие на все этапы онтогенеза растений, приводя к существенным потерям урожайности ключевых продовольственных культур. Наиболее уязвимой стадией жизненного цикла растений является период прорастания семян и формирования первичной корневой системы [1]. В условиях аридности высокий отрицательный осмотический и матричный потенциал среды создает значительный термодинамический барьер, затрудняя диффузию молекул воды сквозь семенную кожуру внутрь эндосперма и зародыша. Недостаток внутриклеточной влаги нарушает осмотический баланс, что приводит к падению тургорного давления и блокировке каскада предро-стовых биохимических реакций. На молекулярном уровне гидротермический стресс провоцирует вторичный окислительный стресс, характеризующийся избыточным накоплением активных форм кислорода (АФК), таких как супероксидный анион-радикал, гидроксильный радикал и пероксид водорода. Избыток АФК инициирует цепные реакции перекисного окисления липидов клеточных мембран, вызывает денатурацию структурных и функциональных белков, а также приводит к повреждениям нуклеиновых кислот, что в итоге ведет к гибели зародыша и снижению полевой всхожести [2, 3].

В условиях глобального истощения запасов пресной воды традиционные экстенсивные методы искусственного орошения в засушливых и полузасушливых регионах становятся экономически нерентабельными и экологически небезопасными из-за угрозы вторичного засоления деградирующих почв [4]. В связи с этим вектор современной агрономической науки смещается в сторону разработки технологий, направленных на повышение эндогенной стрес-соустойчивости самого посевного материала. Одной из наиболее перспективных и научно обоснованных стратегий является предпосевная обработка семян – гидропрайминг (seed priming) и функциональное инкрустирование (seed coating) с использованием биологически активных гидрофильных матриц. Прайминг представляет собой процесс контролируемого увлажнения семян, который переводит семя в физиологически активное состояние, инициируя предростовые метаболические каскады (включая репарацию ДНК и синтез ферментов), но прерывается до момента необратимого проклёвывания корешка [5]. Совмещение прайминга с нанесением гидрофильных полимерных покрытий позволяет создать вокруг семени защитный микроконтейнер, который способен активно захватывать воду из окружающей среды, фиксировать ее в своей пространственной полимерной сетке и постепенно, дозированно отдавать растению даже при высоком осмотическом давлении почвенного раствора [6].

В контексте перехода к принципам устойчивого развития и циркулярной экономики значительный интерес представляет использование в качестве основы для таких покрытий биополимеров белковой природы, извлекаемых из вторичного сырья агропромышленного 55

комплекса. Большим потенциалом обладает основной белок соединительной ткани – коллаген, получаемый из отходов кожевенной и мясоперерабатывающей промышленности. Нативный животный коллаген является эффективным природным гидроколлоидом, однако большие размеры его макромолекул, плотно свернутых в жесткую тройную спираль, ограничивают их диффузию сквозь поры семенной оболочки и делают недоступными для клеточного метаболизма растения [7]. Для повышения биодоступности и осмотической активности биополимер коллаген подвергают термохимической или ферментативной деструкции. В результате многоступенчатого гидролиза (с использованием специфических протеолитических ферментов, таких как алкалаза и др.) полипептидные цепи расщепляются на водорастворимые пептиды со средней молекулярной массой около 10–20 кДа Да и пул свободных аминокислот [8].

Аминокислотный профиль ферментативного гидролизата коллагена существенно отличается от таковых белков растительного происхождения: он содержит высокие концентрации пролина, гидроксипролина, глицина и глутаминовой кислоты [9]. В физиологии адаптации растений к засухе свободный пролин выполняет ключевую роль, выступая в качестве главного внутриклеточного осмопротектора и молекулярного шаперона [10]. Проникая в ткани семени в процессе прайминга, пептиды коллагена снижают внутриклеточный водный потенциал, что позволяет клеткам зародыша термодинамически поглощать воду даже из высокоминерализованных и пересушенных почв. Кроме того, пептиды стабилизируют нативную структуру ферментов, предотвращая их термокоагуляцию при тепловом шоке, а сам гидролизат служит источником биодоступного органического азота. Использование готовых пептидов позволяет развивающемуся проростку снизить затраты энергии, которые в противном случае были бы израсходованы на энергоемкий процесс восстановления неорганических нитратов. Показано, что покрытия на основе коллагеновых гидролизатов стимулируют всхожесть, увеличивают корневую биомассу и повышают общую выживаемость растений в условиях острого водного дефицита [11, 12].

Несмотря на очевидные физиологические преимущества гидролизатов коллагена, их влагоудерживающие свойства и особенно термодинамические характеристики процесса дегидратации остаются практически неизученными. Между тем именно прочность связывания воды в полимерной сетке определяет способность покрытия противостоять высокому осмотическому давлению почвенного раствора и препятствовать вторичному иссушению семени в аридных условиях. Дополнительный интерес представляет модификация пептидных покрытий ионами переходных металлов, в частности цинком, который, с одной стороны, является эссенциальным микроэлементом, необходимым для функционирования супероксиддисмутазы (Cu/Zn-СОД) и биосинтеза ауксинов [13], а с другой – способен выступать в роли сшивающего агента, формирующего координационные связи между пептидными цепями. Формирование металлопептидной сетки может принципиально изменить структуру и энергетику удержания воды, однако количественные теплофизические данные для таких систем отсутствуют. Помимо влагоудерживающей функции принципиальное значение для выживания семян в условиях засухи имеет способность покрытия активировать антиоксидантную защиту, снижая уровень окислительного стресса, индуцированного гидротермическим воздействием.

Цель настоящей работы - сравнительный теплофизический анализ термодинамических характеристик и оценка влагоудерживающей способности семян пшеницы, обработанных биополимером коллагена, ферментативным гидролизатом коллагена и хелатным комплексом гидролизата с цинком.

Материалы и методы исследования

Объектом исследования служили семена пшеницы [Бурятская 79, урожая 2023 г.].

Эксперимент включал четыре варианта обработки:

• 1.    Семена без обработки.

• 2.    Семена, обработанные раствором биополимера коллагена.

• 3.    Семена, обработанные раствором ферментативного гидролизата коллагена.

• 4.    Семена, обработанные раствором хелатного комплекса цинка с гидролизатом коллагена.

Обработку семян проводили методом погружения семян в жидкие биополимеры на 20 мин при комнатной температуре, после чего семена извлекали и подсушивали на воздухе до сыпучего состояния.

Подробное описание полученных ферментативных гидролизатов коллагена, условий гельпроникающей хроматографии и процедуры связывания цинка с пептидами гидролизата приведено в [14–16].

ТГ/ДСК-анализ выполнен на приборе синхронного термического анализа STA 449 F1 Jupiter (Netzsch, Германия) в диапазоне температур 25–450 °С при скорости изменения температуры 10 °/мин в атмосфере воздуха.

Всхожесть определяли по ГОСТ 12038-84 Семена пшеницы проращивали на увлажненной фильтровальной бумаге при температуре 20°С. На 10-е сут подсчитывали долю нормально проросших семян (всхожесть) и измеряли длину ростка и длину корешка у проростков.

Определение суммарного содержания антиоксидантов (ССА) в образцах проводили амперометрическим методом с помощью жидкостного хроматографе «Цвет Яуза-01-АА (НПО «Химавтоматика», 2012) по ГОСТ Р 54037-2010.

Статистическую обработку данных выполняли с расчетом средних арифметических значений (M) и стандартных ошибок среднего (m). Для оценки достоверности межгрупповых различий применяли параметрический t-критерий Стьюдента. Различия считали значимыми при уровне вероятности p ≤ 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Методами синхронного термического анализа (ТГ/ДСК) была проведена сравнительная оценка термического поведения четырех систем: необработанных семян (контроль), семян с покрытием из биополимера коллагена, из ферментативного гидролизата коллагена и хелатного комплекса цинка с гидролизатом. Основное внимание уделяли температурной области (25–450 °C), в которой реализуется эндотермический процесс удаления воды, ассоциированной с полимерной сеткой покрытия и тканями семени.

На рисунке 1 представлены кривые ТГ и ДСК для контрольного образца – семян без

Рисунок 1 – Термограмма (ДСК и ТГ) не обработанного семени пшеницы Обозначения (здесь и далее) синяя кривая – ДСК, зеленая – ТГ

Согласно данным, приведенным на рисунке 1, контрольный образец, представляющий собой интактные семена без модификации поверхности, характеризовался рядом термических 57

событий на кривой ДСК. В низкотемпературной области (50-100 °C) регистрировались слабо выраженные эндотермические пики, которые могут быть отнесены к процессам гелеобразования или начальной денатурации белков семени, а также к удалению остаточной связанной воды, ассоциированной с гидрофильными компонентами зародыша и эндосперма [17, 18]. При наличии значительного количества липидов в отдельных образцах возможно появление дополнительных сигналов в области их плавления [19]. Основной эндотермический эффект представлял собой широкий пик с минимумом при 178,7 °C. Подобный профиль указывает на отсутствие выраженных энергетических барьеров при удалении воды из поверхностных слоев. Свободная и слабосвязанная влага испарялась без существенных затрат энергии, что свидетельствовало о низкой водоудерживающей способности нативной поверхности семени.

Иной характер дегидратации наблюдался у семян, обработанных биополимером коллагена (рис. 2).

Рисунок 2 – Термограмма (ДСК и ТГ) семени пшеницы, обработанной биополимером коллагена

Данные, представленные на рисунке 2, показали, что обработка семян биополимером коллагена приводила к существенному изменению характера термограммы по сравнению с интактным образцом. На кривой ДСК регистрировались выраженные эндотермические пики с минимумами при 116,8 и 166,9 °C. Низкотемпературный пик соответствовал удалению воды из менее упорядоченных областей покрытия, а высокотемпературный – дегидратации плотно упакованных фракций, удерживающих влагу за счет более прочных водородных связей. Общая энтальпия процесса дегидратации значительно возрастала по сравнению с контролем, что указывало на формирование гидрофильного барьера, способного эффективно замедлять потерю влаги семенем.

Наблюдаемая множественность пиков - прямое следствие неоднородности используемого сырья. Коллаген, выделенный из отходов животного производства (кожи, костей, шкур), представляет собой смесь различных типов белка (I, II, III и др.), различающихся аминокислотной последовательностью и степенью посттрансляционных модификаций (гликозилирование, окисление) [20]. Каждый из этих компонентов характеризуется собственной температурой денатурации, поэтому вместо одиночного пика, типичного для гомогенного препарата, термограмма демонстрирует суперпозицию нескольких эндотермических сигналов. Такая структурная гетерогенность полимерной матрицы обусловливает наличие участков с различной плотностью упаковки цепей и, как следствие, разной водоудерживающей способностью [21].

Переход от биополимера к его ферментативному гидролизату принципиально менял характер распределения влаги (рис. 3).

Рисунок 3 – Термограмма (ДСК и ТГ) семени пшеницы, обработанной гидролизатом коллагена

Как демонстрирует рисунок 3, переход от нативного коллагена к его ферментативному гидролизату сопровождался принципиальным изменением характера термограммы. На кривой ДСК регистрировались эндотермические пики, смещенные в область более низких температур - 107,2 и 155,7°C. Наблюдаемое смещение температурного интервала деструкции являлось прямым следствием ферментативного расщепления полипептидных цепей на короткие пептидные фрагменты [22, 23]. Разрушение тройной спирали нативного коллагена обусловливало исчезновение характерного высокотемпературного пика денатурации [24]: короткоцепочечные пептиды не формируют упорядоченную трехмерную структуру, для дестабилизации которой требуются значительные энергетические затраты, вследствие чего их термическая деструкция протекает в области более низких температур. Короткие пептидные фрагменты сохраняют способность образовывать на поверхности семени гелеобразную сетку за счет межмолекулярных водородных связей и иных нековалентных взаимодействий [25]. Такая сетка эффективно удерживает влагу, однако ее термическая стабильность закономерно уступает стабильности покрытия, сформированного нативным белком.

Введение в гидролизат ионов цинка инициировало формирование координационно-сшитой металлопептидной сетки, что качественно меняло термодинамические параметры процесса удержания влаги (рис. 4).

обработанной комплексом «гидролизат коллагена + цинк»

Согласно данным, приведенным на рисунке 4, введение ионов цинка в структуру пептидного покрытия приводило к дальнейшему изменению термодинамики дегидратации. На кривой ДСК регистрировались эндотермические пики при 102,5 и 160,5 °C, причем положение высокотемпературного пика практически достигало значений, характерных для наиболее термостабильных фракций биополимера коллагена (166,9 °C на рисунке 2). Данный результат является прямым следствием формирования координационных связей между ионами Zn²⁺ и функциональными группами пептидных цепей – карбоксильными, аминными и сульфгидрильными [18]. Ионы цинка выполняют роль мостиков, сшивающих отдельные короткие пептиды в более плотную и упорядоченную трехмерную сеть [26]. Разрушение такой хелатированной матрицы требует бо́льших энергозатрат по сравнению с разрушением нековалентных ассоциатов в немодифицированном гидролизате, что выражается в смещении эндотермического пика в область более высоких температур [27].

Сопоставление с данными для биополимера коллагена показало, что хелатирование цинком позволяет в значительной степени компенсировать потерю термической стабильности, вызванную ферментативным гидролизом (рис. 5).

Рисунок 5 - Сравнительные кривые термограммы (ДСК и ТГ) для всех исследуемых образцов, • -нативный коллаген, • - гидролизат коллагена+цинк, • - гидролизат коллагена, • - без обработки

Похожие результаты показаны в работе [28]. Покрытие на основе хелатного комплекса сочетает технологические преимущества гидролизата (низкая вязкость, высокая растворимость, гомогенность нанесения) с повышенной термостойкостью.

С позиции использования хелатных комплексов коллагена с цинком в предпосевной обработке семян это означает, что модифицированное цинком покрытие способно формировать прочный гидрофильный барьер, эффективно удерживающий влагу в микроокружении семени даже при значительном нагреве, и тем самым создавать более благоприятные условия для прорастания.

Для оценки биологического эффекта исследуемых систем было проведено лабораторное определение всхожести и морфометрических показателей проростков (рис. 6, 7).

Контроль

Гидролизат

Гидролизат+Цинк

Рисунок 6 – Результаты лабораторной оценки всхожести семян пшеницы

Данные рисунка 6 демонстрируют существенное увеличение всхожести при переходе от контроля к обработанным образцам. Семена пшеницы без обработки характеризовались минимальной всхожестью (11 %), что согласуется с данными ТГ/ДСК: отсутствие внешнего гидрофильного покрытия и крайне низкий собственный гидратный резерв ограничивают инициацию метаболических процессов прорастания. Нанесение ферментативного гидролизата коллагена повышало всхожесть до 41 %, что обусловлено формированием на поверхности и в порах семени пептидной пленки, способной удерживать прочносвязанную воду. Введение хелатного комплекса цинка с гидролизатом коллагена в состав покрытия обеспечивало дальнейший рост всхожести до 55,5 %.

□ Длина ростка □ Длина корешка

Рисунок 7 – Морфометрические показатели проростков

Морфометрические показатели на рисунке 7 свидетельствуют о положительном влиянии обработок на развитие как надземной, так и корневой частей проростка. Обработка гидролизатом привела к увеличению длины ростка почти в 4 раза по сравнению с контролем (с 0,48 до 1,88 см) и возрастанию длины корешка до 2,33 см. Введение хелатных комплексов гидролизата коллагена с цинком несколько снизил среднюю длину ростка (1,69 см), однако при этом обеспечил максимальную длину корешка (2,67 см) с наименьшим разбросом значений. Такое перераспределение ростовых процессов в пользу корневой системы является характерным ответом на присутствие биодоступного цинка, который, как известно, активирует биосинтез ауксинов и стимулирует ризогенез [13]. В условиях аридного стресса ускоренное формирование более развитой корневой системы повышает шансы проростка на достижение влажных горизонтов почвы.

Для оценки влияния покрытий на устойчивость семян к окислительному стрессу была исследована их суммарная антиоксидантная активность (САА), данные представлены в таблице.

Таблица

Суммарная антиоксидантная активность семян пшеницы при различных вариантах обработки

Вариант обработки	Суммарная антиоксидантная активность, мг/г
Семена без обработки	1,80 ± 0,14
Семена, обработанные нативным коллагеном	2,15 ± 0,02
Семена, обработанные гидролизатом коллагена	2,33 ± 0,05
Семена, обработанные гидролизатом коллагена+цинк	3,01 ± 0,06

Полученные данные свидетельствуют о том, что семена без обработки (контроль) показали самую низкую антиоксидантную активность (1,80 ± 0,14 мг/г). Обработка семян биополимером коллагена привела к повышению показателя (2,15 ± 0,02 мг/г). Ограниченный эффект биополимера связан с большими размерами его макромолекул: активные аминокислотные остатки спрятаны внутри молекулы и недоступны для клеточного метаболизма, а сам белок ограничен в диффузии сквозь поры семенной оболочки [29].

Использование ферментативного гидролизата коллагена заметно повышало антиоксидантную активность обработанных семян (до 2,33 ± 0,05 мг/г). Это, по-видимому, связано с тем, что ферментативная деструкция расщепляет полипептидные цепи на водорастворимые пептиды и пул свободных аминокислот [30, 31]. В результате разрушения структуры высвобождаются ранее скрытые функциональные радикалы аминокислот, которые активно участвуют в реакциях нейтрализации избытка активных форм кислорода (АФК) [32].

Наибольшая антиоксидантная активность (3,01 ± 0,06 мг/г) достигнута при формировании на поверхности семени покрытия из хелатного комплекса гидролизата коллагена с цинком. Анализ структурных механизмов связывания показывает, что ионы цинка выступают в роли сшивающего агента, формирующего координационные связи между пептидными цепями. Кроме того, цинк является эссенциальным микроэлементом, необходимым для функционирования собственной антиоксидантной системы проростка (в частности, супероксиддисмутазы) [33]. В результате полученный металлокомплекс проявляет выраженный синергетический эффект и самую высокую функциональную активность по сравнению с несвязанными пептидами.

Таким образом, результаты оценки посевных качеств полностью согласуются с данными теплофизического анализа: прочное связывание воды в цинк-пептидной сетке обеспечивает максимальную всхожесть и способствует формированию проростков с развитой корневой системой, что является критически значимым для выживания в условиях засухи.

Заключение

В работе проведен сравнительный анализ влагоудерживающей способности и термостабильности покрытий на основе биополимера коллагена, его ферментативного гидролизата и хелатного комплекса цинка с гидролизатом, нанесённых на семена пшеницы. С использованием методов синхронного термического анализа (ТГ/ДСК) установлены принципиальные различия в характере дегидратации и термического поведения исследованных систем.

Биополимер коллагена характеризовался высокой влагоемкостью; при этом вода удерживалась преимущественно в макропорах и капиллярах гелевой матрицы, что обусловливало быстрое испарение влаги при нагревании. Ферментативный гидролизат, в свою очередь, формировал более прочную гидратную оболочку, которой соответствовал растянутый низкотемпературный эндотермический пик с максимумом при 107,4 °C. Данный характер сигнала свидетельствует об удержании воды посредством множественных водородных связей с пептидными фрагментами, проникающими в микропоры семенной оболочки.

Введение ионов цинка и образование координационно-сшитой металлопептидной сетки существенно изменяли термодинамику дегидратации. На кривых ДСК это проявлялось в смещении максимума эндотермического пика к 102,0 °C и одновременном уменьшении количества удаляемой влаги при увеличении энергетических затрат на ее испарение. Подобные изменения указывают на формирование более прочных, но менее емких связей «вода - матрица» в присутствии Zn²⁺ .

Теплофизические преимущества цинк-пептидного комплекса согласуются с результатами оценки посевных качеств. Лабораторная всхожесть семян возрастала с 11 % (контроль) до 41 % после обработки гидролизатом и до 55,5 % при использовании комплекса с цинком. Морфометрический анализ продемонстрировал, что присутствие цинка в покрытии специфически стимулирует развитие корневой системы: длина корешка достигала 2,67 см (против 1,65 см в контрольной группе). В условиях водного дефицита такое развитие корня является критическим адаптивным признаком и соответствует известной роли цинка как кофактора биосинтеза ауксинов и компонента антиоксидантной защиты.

Анализ суммарной антиоксидантной активности показал, что минимальный уровень (1,80 ± 0,14 мг/г) зафиксирован у необработанных семян. Использование биополимера коллагена повышало показатель до 2,15 ± 0,02 мг/г; жесткая структура биополимера ограничивает доступность активных центров и диффузию белка в ткани семени. Применение ферментативного гидролизата увеличивало активность до 2,33 ± 0,05 мг/г за счет высвобождения низкомолекулярных пептидов и аминокислот, нейтрализующих активные формы кислорода. Максимальное значение (3,01 ± 0,06 мг/г) достигалось при использовании хелатного комплекса с цинком, что объясняется одновременным структурированием пептидной матрицы ионами Zn²⁺ и их функционированием в качестве кофактора антиоксидантных ферментов.

Совокупность полученных данных дает основания рассматривать хелатный комплекс гидролизата коллагена с цинком как полифункциональное покрытие для предпосевной обработки семян, предназначенных для возделывания в аридных и полуаридных регионах. Термодинамически прочное удержание воды в металлопептидной сетке снижает риск вторичного иссушения семени и способствует постепенному увлажнению зародыша, а пролонгированное высвобождение биодоступного цинка обеспечивает формирование развитой корневой системы, повышающей засухоустойчивость проростков. Дальнейшие исследования должны быть направлены на оптимизацию состава комплекса и проведение полевых испытаний на различных сельскохозяйственных культурах.