Оценка гемолитической активности вакцинных штаммов возбудителя сибирской язвы

Как известно, патогенность бактерий обусловлена способностью продуцировать экзо- и эндотоксины (1, 2). Как грамположительные (стафилококки, стрептококки, пневмококки, листерии и др.), так и грамотрицательные (эшерихии, псевдомонады и др.) бактерии различных видов синтезируют внеклеточные токсические белки — гемолизины, разрушающие мембраны эритроцитов животных и человека. Данные литературы о способности возбудителя сибирской язвы продуцировать белки, обладающие гемолитической активностью, весьма противоречивы (3, 4). Это обусловлено, вероятно, тем, что большинство авторов связывают патогенность этого возбудителя с продуцированием токсина и капсульной субстанции, а роль гемолизинов в патогенезе сибирской язвы не так значительна, поэтому до настоящего времени практически не изучена.

При оценке гемолитической активности возбудителя сибирской язвы в Ставропольском научно-исследовательском противочумном институте и Российском научно-исследовательском противочумном институте «Микроб» (Саратов) все изученные штаммы были разделены на две группы: гемнегативные (в основном вакцинные и атипичные по капсулообразованию) и гемпозитивные (вирулентные изоляты и вакцинные штаммы Ихтиман и Sterne) (5, 6). В ходе комплексных исследований корреляции между вирулентностью и экспрессией таких фенотипических признаков возбудителя сибирской язвы, как протеолитическая и гемолитическая активность, пиг-ментосорбция, пигментосинтез и спорообразование, не отмечена наследственная обусловленность последних при реализации патогенетических процессов у мышей; у морских свинок выявлено достоверное снижение вирулентности изогенных вариантов штаммов, которые не обладают этими признаками (6, 7). Кроме того, показано, что иммунизация золотистых хомячков вакциной из штамма СТИ-1 защищает от заражения вирулентным штаммом Ч-7 и неэффективна в отношении рекомбинантного штамма Ч-7, в ДНК которого интегрирован ген AB цереолизина из штамма ВКМ-В164 Bacillus cereus , что является косвенным доказательством участия гемолизинов в проявлении патогенных свойств (8).

При определении гемолитической активности Bacillus anthracis следует учитывать, что продукция гемолизинов и возможность их обнаружения находятся в зависимости от целого ряда условий: типа гемолизина, состава питательной среды, качества и концентрации эритроцитов, чувствительности последних у разных видов животных, методики проведения тестов и др. В связи с этим в задачу нашей работы входила сравнительная оценка существующих методов и разработка более чувствительной тест-системы, позволяющей определять гемолитическую активность штаммов B. anthracis .

Описание методики. В работе использовали следующие вакцинные штаммы возбудителя сибирской язвы: 55-ВНИИВВиМ, СТИ, СТИ-1, Sterne (фирма Websters, Австралия), 34 F 2 , Ихтиман, М 71, 71/12, а также штаммы-сапрофиты ¹ 96 и ¹ 8035 близкородственного вида B. cereus . Культивирование проводили в чашках Петри и пробирках на плотных и жидких питательных средах — МПА (мясопептонный агар), МПБ (мясопептонный бульон).

Количество жизнеспособных спор, полученных при культивировании возбудителя на картофельном агаре в течение 7 сут, определяли посредством высева проб из серийных (10-кратных) разведений на агаровую среду в чашки Петри. Гемолитическую активность B. anthracis оценивали следующими методами: стандартным, луночным (по Цыганковой), на однослойном (по Шевченко) и двуслойном агаре (по разработанной нами схеме).

С т а н д а р т н ы й м е т о д (9). Бульонные культуры возбудителя сибирской язвы высевали петлей на кровяной агар (2-2,5 % агар Хоттингера или МПА с добавлением 5-10 % дефибринированной крови барана) и инкубировали при температуре 36 ± 1 ^оС. После 24-48 ч инкубации зоны лизиса эритроцитов отсутствовали. При более продолжительном инкубировании наблюдалось просветление агара вокруг колоний, что, однако, могло быть результатом действия как гемолизинов, так и компонентов питательной среды.

Л у н о ч н ы й м е т о д (5). В двуслойном кровяном агаре (1 % подложечный и 0,7 % покрывной агар «Дифко» на физиологическом растворе с добавлением в последний 6 % эритроцитов барана, отмытых физиологическим раствором) пробойником диаметром 8 мм делали лунки (6-7 шт. на одну чашку Петри), дно которых запаивали 1 -2 каплями расплавленного агара. В эти лунки вносили по 0,1 мл односуточной бульонной культуры и инкубировали при температуре 36 ± 1 ^оС; через 24, 48, 72 и 96 ч по ширине зоны гемолиза (зона просветления вокруг лунок вследствие полного разрушения эритроцитов) определяли гемолитическую активность.

При этом все испытанные штаммы лизировали эритроциты крови барана, что, однако, не согласуется с данными Цыганковой, по которым вакцинные штаммы СТИ, 71/12 и другие были отнесены к группе гемолитически неактивных. Это, видимо, связано с различиями в методах подготовки эритроцитов барана, так как при использовании крови других видов животных и человека эти штаммы вызывали лизис эритроцитов (5). Луночный метод позволяет определять лишь суммарную гемолитическую активность всей популяции возбудителя, зависящую от репродуктивной способности изолятов B. anthracis , и не пригоден для клонального анализа при изучении популяционной гетерогенности или стабильности штаммов. К тому же рост колоний по краю лунки на покрывном слое агара в процессе инкубирования искажает достоверность оценки.

Т е с т - с и с т е м а н а о д н о с л о й н о м а г а р е (6). На поверхность 1,5 % L-агара, приготовленного на основе среды Лурия-Бертани и содержащего 5 % взвеси эритроцитов, 5-кратно отмытых в ASE-буфере (декстроза, цитрат натрия и хлористый натрий соответственно в концентрации 20,5; 7,9 и 4,2 г/л; рН 6,1), наносили посевной материал колоний B. anthracis (однократное касание стеклянный палочкой или иглой) и инкубировали. В связи с тем, что диффузия секретируемых гемолизинов в толщу 1,5 % L-агара, содержащего эритроциты, затруднена, инкубацию проводили в течение 48-72 ч. Гемолитическую активность возбудителя сибирской язвы определяли также по ширине зоны гемолиза вокруг колоний. При низкой и средней гемолитической активности изолятов и высокой репродуктивной способности бактерий зона роста колонии может перекрывать зону гемолиза или совпадать с ней, что искажает результаты анализа. Кроме того, при содержании 5 % взвеси эритроцитов количество экспрессируемых гидролизинов было недостаточным для их полного лизиса.

Следовательно, вышеописанные методики не позволяют в полной мере проанализировать гемолитическую активность различных штаммов B. anthracis , в том числе, имеющих пониженную продукцию этого токсина.

Т е с т - с и с т е м а н а д в у с л о й н о м а г а р е. При разработке более эффективного способа определения гемолитической активности возбудителя сибирской язвы нами в качестве основы была использована модифицированная двуслойная агаровая среда с оптимальным соотношением компонентов и подобраны условия постановки реакции. С целью повышения чувствительности эритроцитов к гемолизинам возбудителя их 3-кратно отмывали физиологическим раствором или 5-кратно ASE-буфером (10). Для определения гемолитической активности и типа отдельных колониеобразующих единиц B. anthracis в чашку с двуслойным агаром вносили спо115

ровую суспензию возбудителя в рабочем разведении 0,1 ± 0,01 см³ (2-10 спор на одну чашку), равномерно распределяли посевной материал по поверхности агара, подсушивали 30-40 мин при комнатной температуре и инкубировали при 36 ± 1 ^оС. Для оценки гемолитической активности и типа популяции возбудителя посевной материал колонии или бульонную культуру B. anthracis наносили стеклянной палочкой (иглой) на поверхность двуслойного кровяного агара и инкубировали. Тип гемолиза оценивали визуально по отсутствию или наличию зеленоватой окраски в зоне лизиса эритроцитов — соответственно β - или α -гемолиз. Гемолитическую активность изоля-тов или штаммов B. anthracis оценивали через 48 ч по соотношению радиуса колонии ( r к ) и ширины зоны гемолиза:

Радиус колонии ( r к )

Гемолитическая активность

Высокая

Средняя

Низкая

Меньше ширины зоны гемолиза

Равен или превышает ширину зоны гемолиза менее чем в 2 раза

Превышает ширину зоны гемолиза в 2 раза и более

При разных способах обработки эритроцитов существенных различий по чувствительности последних к гемолизинам не выявлено, но декстроза, содержащаяся в ASE-буфере, стимулировала репродукцию бактериальных клеток, приводя к разрастанию колоний, что в последующем затрудняло оценку результатов.

При посеве спор восьми штаммов B. anthracis на поверхности агара появлялись отдельные колонии. Через 24-48 ч вокруг колоний всех штаммов образовывалась четко ограниченная зона гемолиза: у пяти штаммов — прозрачная ( β -тип), а у трех — окрашенная в зеленоватый цвет ( α -тип) (табл.).

Оценка гемолитической активности вакцинных штаммов Bacillus anthracis при использовании модифицированной двуслойной агаровой среды

Штамм возбудителя	Тип гемолиза	Соотношение радиуса колонии и ширины зоны гемолиза		Степень гемолитической активности
		мм        1	кратность
55-ВНИИВВиМ	β β	4,00/3,00	1,3	Средняя
СТИ	β β	2,50/5,30	0,5	Высокая
СТИ-1	β β	5,25/2,75	1,9	Средняя
Sterne	α α	4,35/1,25	3,5	Низкая
34F 2	α α	2,40/3,00	0,8	Высокая
Ихтиман	α α	6,75/0,75	9,0	Низкая
М 71	β β	3,75/4,25	0,9	Высокая
71/12	β β	2,75/3,50	0,8	Высокая

Ширина зоны гемолиза у штаммов варьировала от 0,75 до 5,3 мм, что отражало уровень гемолитической активности. Наибольшая гемолитическая активность выявлена у штаммов СТИ, М 71, 71/12, 34 F 2 , наименьшая — у штаммов Ихтиман и Sterne. По данным Цыганковой, штаммы Ихтиман и Sterne относились к группе гемолитически активных, так как продуцировали гемолизины на уровне типичных полевых изолятов. По результатам наших исследований, степень гемолитической активности обоих штаммов была низкой. Это противоречие объясняется тем, что штаммы Ихтиман, Sterne и СТИ-1 по сравнению с остальными изученными штаммами обладали более высокой репродуктивной способностью, косвенным показателем которой является радиус колонии.

Штаммы B. cereus ¹ 96 и ¹ 8035 характеризовались β -типом гемолиза и ползучим ростом, который был обусловлен подвижностью микроорганизмов. Кроме того, штаммы сапрофитов инкубировали при комнатной температуре, так как при 36 ± 1 ^оС уже через 24 ч на поверхности агара образовывался монослой культуры.

Учитывая, что сыворотка крови обладает ингибирующим действием по отношению к гемолизинам, с целью сравнительной оценки активности α - и β β -гемолизинов была приготовлена двуслойная среда, содержащая в покрывном слое агара 4 % дефибринированной крови кролика. Штаммы оценивали по вышеописанной методике. Через 24-48 ч штаммы, имеющие α -тип гемолиза (Ихтиман, Sterne, 34 F 2 ), вызывали деградацию эритроцитов, при этом зона гемолиза либо совпадала, либо 116

слегка выступала за край колонии. Штаммы, обладающие β -типом гемолиза, не вызывали лизиса эритроцитов даже через 72 ч инкубирования. Полученные данные свидетельствуют о том, что сыворотка крови полностью блокирует действие β -гемолизинов и оказывает незначительное ингибирующее действие на α -гемолизины.

Итак, восемь исследованных вакцинных штаммов B. anthracis продуцируют экзотоксины, которые вызывают лизис эритроцитов по α - (Ихтиман, Sterne, 34 F₂) или β β -типу (55-ВНИИВВиМ, СТИ, СТИ-1, М 71, 71/12), причем штаммы различаются по уровню гемолитической активности, что позволяет проводить их дифференциацию.

Таким образом, разработанная нами методика на основе использования модифицированной двуслойной агаровой среды дает возможность оценивать гемолитическую активность отдельных колониеобразующих единиц или популяций B. anthracis , определять тип гемолиза и степень ферментативной активности в любой из периодов развития колоний, дифференцировать штаммы, а также изучать стабильность и изменчивость изолятов возбудителя. При этом следует отметить высокую чувствительность и наглядность метода.

Л И Т Е Р А Т У Р А

• 1.    З а в и р ю х а А.И., С т е п а н ю к О.П. Дифференциальная диагностика возбудителя сибирской язвы от ложносибиреязвенных бацилл. В сб.: Достижения и перспективы борьбы с сибирской язвой в СССР. М., 1978: 130-131.

• 2.    С т е п а н о в А.С., А к с е н о в Д.А., П а р х о м е н к о А.А. и др. Получение коллекции опосредованных транспозонами Tn917, Tn916 и Tn916E инсерционных мутантов возбудителя сибирской язвы. В сб.: Актуальные вопросы профилактики опасных инфекционных заболеваний. Киров, 1991: 154155.

• 3.    Л о б з и н Ю.В., В о л ж а н и н В.М., З а х а р е н к о С.М. Сибирская язва. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия, 2002, 2, 4: 104-127.

• 4.    М а р и н и н Л.И., О н и щ е н к о Г.Г., С т е п а н о в А.В. и др. Микробиологическая диагностика сибирской язвы, М., 1999.

• 5.    Ц ы г а н к о в а О.И. Гемолитическая и протеолитическая активность сибиреязвенного микроба. Автореф. канд. дис. Саратов, 1993.

• 6.    Ш е в ч е н к о О.В. Протеолитическая активность возбудителя сибирской язвы. Автореф. канд. дис. Саратов, 1999.

• 7.    М и к ш и с Н.И., Е р е м и н С.А., Б о л о т н и к о в а М.Ф. Корреляция вирулентности Bacillus anthracis с экспрессией признаков, кодируемых хромосомными генами. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 1999, 4: 25-28.

• 8.    P o m e r a n t s e v A.P., S t a r i t s i n N.A., M o c h o v Yu.V. e.a. Expression of cereolysine AB genes in Bacillus anthracis vaccine strain ensures protection against experimental hemolytic anthrax infection. Vaccine, 1997, 15, 17/18: 1846-1850.

• 9.    Методические указания по лабораторной диагностике сибирской язвы у животных и людей, обнаружению возбудителя сибирской язвы в сырье животного происхождения и объектах внешней среды. М., 1989.

• 10.    L e p p l a S.H. Agar plate methods for screening B. anthracis for mutants. Bacteriology division, 1988, 301: 663-667.

Всероссийский НИИ ветеринарной вирусологии и              Поступила в редакцию микробиологии, 601121, Владимирская обл., Петушинский                 29 октября 2002 года р-он, г. Покров

ESTIMATION OF HEMOLYTIC ACTIVITY OF VACCINE STRAINS OF ANTHRAX AGENT Yu.O. Selyaninov, I.Yu. Egorova

S u m m a r y

The authors made the comparative estimation of methods for determination of hemolytic activity of vaccine strains of anthrax agent. By the modified method of agar layers it was revealed, that different strains of Bacillus anthracis express the exotoxins, which cause the erythrocytes lysis on α - or β -type. It was shown, that this method permit to differentiate the B. anthracis strains to a high accuracy and also to estimate enzymatic activity in individual colony-forming units or populations on the periods of development.

Новые книги

Научные основы сохранения и совершенствования пород лошадей. Сб. науч. тр. /Под ред. С.С. Сергиенко. Дивово: ВНИИ коневодства, 2002, 345 с.

В сборнике представлены результаты работ по селекции, иммуногенетике, физиологии тренинга лошадей, а также экономике коневодства. Дана оценка плодовитости кобыл орловской рысистой породы в зависимости от резвости и возраста, а также молочной продуктивности и состава молока кобыл при содержании на кумысных фермах в различных регионах. Обсуждаются проблемы сохранности типа и экстерьера лошадей разных пород. Рассматриваются перспективы развития тяжеловозного коневодства. Описаны поведенческие и физиологические особенности северных лошадей. Проанализированы возможности использования генетических маркеров в коневодстве, а также перспективы криобиологических исследований для трансплантации эмбрионов у лошадей. Уделено внимание генетической детерминации гемолитической болезни жеребят.

Стратегия и основные направления развития овцеводства и козоводства в России. Сб. статей и докл. междунар. науч.-практ. конф.

(Ставрополь, 23-25 октября 2002 г.). Ставрополь: СНИИ животноводства и кормопроизводства, 2002, 283 с.

В сборнике отражены перспективы развития овцеводства и козоводства по регионам России. Рассматриваются вопросы разведения, воспроизводства, кормления, шерстоведе-ния, а также физиологические и иммуногенети-ческие особенности овец и коз разных пород. Проанализирована возможность использования биохимического полиморфизма крови в селекции овец, коз и пастушьих овчарок породы келпи. Обсуждается стратегия восстановления мериносового овцеводства в степной зоне Поволжья. Дана оценка продуктивности коз оренбургской породы, а также ягнят ставропольской породы в зависимости от степени оброслости песижным волосом. Уделено внимание возможности использования неспецифического биостимулятора «Минерол» при выращивании молодняка овец в период подсоса, а также нетрадиционных кормов в рационах баранов-производи-телей и ярок. Охарактеризована энергетическая ценность пастбищного корма для овец. Представлены результаты анализа поведения маток при разных сроках стрижки.