Оценка генетического разнообразия образцов капусты кочанной (Brassica oleracea L.) с использованием SSR маркеров

Китай, Индия и Российская Федерация — основные производители капусты в мире, причем Россия оставляет за собой лидерство в ее потреблении (1). Капуста обладает антиоксидантными свойствами благодаря содержанию полифенолов, антоцианов, галловой, ванилиновой и кумаровой кислот. В ее биохимический состав входят такие антивоспалительные вещества, как глутамин и флавоноиды. Капуста также служит прекрасным источников витамина С и глюкозинолатов (2).

Из вида Brassica oleracea L. (CC, 2 n = 18) наиболее известна капуста белокочанная B. oleracea L. сonvar. capitata L. Alef. var. capitata (L.) f. alba DC. как наиболее употребляемая в России. В меньшей степени известны краснокочанная B. oleracea L. сопуаг. capitata (L.) Alef. var. capitata (L.) f. rubra (L.) Thell., савойская B. oleracea L. convar. capitata (L.) Alef. var . sabauda L., цветная B. oleracea L. convar. botrytis (L.) Alef. var. botrytis L., брокколи B. oleracea L. convar. botrytis (L.) Alef. var. italica Plenck, брюссельская B. oleracea L. convar. gemmifera (DC.) Gladis var. gemmifera DC., кольраби B. oleracea L. convar. acephala (DC.) Alef. var. gongylodes L. и декоративная листовая B. oleracea L . convar. acephala (DC.) Alef. var. sabellica L. Сорта и высокопродуктивные гибриды — ожидаемый результат селекционной работы с видом B. oleracea L. Отличительная особенность кочанных капуст сonvar. capitata — наличие форм с наиболее длительным периодом яровизации и морозоустойчивостью. Первоначальное формирование биоразнообразия капусты кочанной происходило в Западном Средиземноморье, а также в Западной и Северной Европе, откуда она распространилась в Восточную Европу, Америку, страны Азии (Китай, Япония), Австралию и Африку. Ее широкому распространению способствовали такие свойства, как высокая урожайность и транспортабельность. Капуста кочанная характеризуется значительным сортовым разнообразием по скороспелости, не требовательна к теплу, обладает положительной реакцией на длинный световой день и отзывчива на применение технологий возделывания, позволяющих увеличить период вегетации (3).

Для рационального использования генетических ресурсов и получения новых форм с высоким показателем гетерозиса и стабильности проявления хозяйственно ценных признаков необходимо знать генетическую основу используемого материала. Кроме того, с появлением нового селекционного материала нужно различать все генотипы и идентифицировать среди них одинаковые или близкородственные. Использование ДНК маркеров на основе микросателлитных повторов (simple sequence repeats, SSR) облегчает задачу точной генетической классификации селекционных образцов. Преимущества микросателлитных маркеров над другими заключаются в надежности и выявлении высокого генетического полиморфизма, что делает их наиболее популярными и универсальными в генетических исследованиях сельскохозяйственных культур (4-6).

Накопление информации по изменчивости микросателлитных локусов привело к созданию базы данных, где общее количество микросателлитных маркеров для видов рода Brassica L., включая B. oleracea, достигало 398 (7). С использованием этих данных были установлены и подтверждены генетические взаимосвязи между видами рода Brassica (8-10). Проведен генетический анализ внутри вида B. oleracea и получены сведения о взаимосвязях как между разновидностями капусты, так и среди сортов и селекционных линий (11-14). Филогенетические исследования вида B. oleracea также проводили на основе изменчивости микросателлитов (15). Коллек- цию из 91 коммерческого образца капусты белокочанной проанализировали по 69 микросателлитным маркерам, которые выявили 359 аллелей, разделенных на 6 кластеров. В первые два входили генотипы капусты белокочанной, в остальные — генотипы разновидностей брокколи, цветной, кольраби и листовой капусты (16). Среди различных селекционных образцов капусты белокочанной была определена высокая генетическая изменчивость с возможностью точного типирования каждого растения на основе полиморфизма микросателлитов (17).

Обобщая результаты предыдущих исследований, нужно отметить, что число работ по изучению генетического разнообразия традиционных отечественных сортов и гибридов капусты кочанной ограничено. Сорта, выведенные и районированные с участием Е.М. Поповой еще в 1940-х годах на Грибовской опытной станции, и сегодня используются как исходный селекционный материал для получения новых форм.

В настоящей работе мы впервые установили генетические взаимосвязи между селекционными образцами капусты кочанной отечественной селекции на основе полиморфизма микросателлитных локусов. При сравнении трех разновидностей обнаружена тесная генетическая близость между генотипами савойской и белокочанной капусты.

Нашей целью было выявление генетических взаимоотношений между селекционными образцами Brassica oleracea L. сonуar. capitata (L.) Alef. уаг. capitata L. f. alba , var. capitata L. f. rubra и var. sabauda L. на основе типирования и генетической классификации с помощью SSR маркеров, а также сопоставление данные ДНК-анализа с принадлежностью изученных генотипов к соответствующими сортотипам и группами спелости.

Методика . Объектом исследования были 24 селекционных образца капусты кочанной из генетической коллекции (Уникальная научная установка, ВНИИССОК) Федерального научного центра овощеводства (ФГБНУ ФНЦО). Геномную ДНК выделяли из молодых листьев растений в фазу 23-го листа методом на основе СТАВ буфера с использованием набора реагентов Сорб-ГМО-Б (ООО «Синтол», Россия) согласно прилагаемому протоколу производителя. Перед выделением ткань молодых листочков (от пяти растений каждого образца) подвергали гомогенизации в экстракционном буфере на приборе TissueLyser II («Qiagen», Германия) (частота 26 Гц, 1560 колебаний/мин, продолжительность 1,7 мин). Конечную чистоту и концентрацию выделенной ДНК определяли на спектрофотометре SmartSpec Plus («Bio-Rad», США). Для проведения амплификации использовали растворы ДНК с OD 260/280 = 1,6-1,8.

Для осуществления SSR-анализа был отобран 21 микросателлитный локус с известными последовательностями праймеров (11, 12), которые в предыдущих исследованиях показывали значения PIC (рolymorphism information content, величина информационного полиморфизма) не менее 0,5. Базовую постановку ПЦР проводили в реакционной смеси (объем 25 мкл), которая включала 2,5 мкл 10 х ПЦР буфера, 2,5 мМ MgCl 2 , 0,25 мМ каждого dNTP, 0,3 мкМ каждого праймера, 1,5 ед. Taq ДНК-полимеразы (ООО «Синтол», Россия) и 3 мкл ДНК каждого исследуемого образца. Основной протокол амплификации включал следующие этапы: 45 с при 92-95 ° С (денатурация), 30 с при температуре от 52 до 58 ° С в зависимости от пары праймеров (отжиг), от 30 с до 1 мин при 72 ° С (элонгация). Амплификацию, рассчитанную на 35 циклов, осуществляли на приборе С1000 Touch («Bio-Rad», США).

ПЦР-продукты разделяли методом вертикального электрофореза с использованием системы Sequi-Gen GT («Bio-Rad», США) в 6 % поли-892

акриламидном секвенирующем геле при напряжении 1600 В в течение 1,52 ч. После электрофореза гели окрашивали красителем для гелей SYBR™ Safe DNA Gel Stain («Invitrogen», США), результаты документировали с использованием системы ChemiDoc XRS+ («Bio-Rad», США). Размеры ампли-фицированных фрагментов определяли в сравнении с маркером молекулярных масс GeneRulerlOO bp plus DNA ladder («Thermo Fisher Scientific», США). Полученные цифровые фотографии электрофореграмм анализировали в программе Image Lab 3.0 («Bio-Rad», США).

Для каждого SSR-локуса учитывали присутствие и отсутствие продукта (соответственно 1 и 0) для составления итоговой бинарной матрицы. Для каждого праймера рассчитывали значение PIC (18). Структуру популяции изучали в программе STRUCTURE 2.3.4 (18), для определения значения ДК использовали программу STRUCTURE HARVESTER v0.6.1 (20). Анализ данных в STRUCTURE не предусматривал информации о числе кластеров, поэтому их вероятное число определяли от 1 до 12 с последующим сравнением К для каждого из вариантов. Генетические расстояния рассчитывали в программе GenAlEx 6.5 (21) для Microsoft Excel по методу M. Nei (22, 23). Для построения UPGMA дендрограммы использовали алгоритм программы MEGA5.2 (24).

Результаты. Изученные образцы и разновидности капусты кочанной приведены в таблице 1, характеристики полиморфных микросателлитных локусов для вида B. oleracea , использованных в работе, указаны в таблице 2.

1. Селекционные образцы, отобранные для оценки генетического разнообразия капусты кочанной ( Brassica oleracea L.) с использованием SSR маркеров (коллекция ФГБНУ Федерального научного центра овощеводства)

Название            |           Сортотип           | Обозначение

Образцы eonvar. capitata (L.) Alef. var. capitata L. f. alba DC

Амагер 611	Амагер	Ama
Аврора F 1	Дитмарская ранняя	Avr
Аврора F 1 линия 1	Дитмарская ранняя	AvL1
Аврора F 1 линия 2	Дитмарская ранняя	AvL2
Белорусская 455	Белорусская	Bel
Зарница F 1	Дитмарская ранняя	Zar
Зимовка 1474	Лангендейская зимняя	Zim
Июньская 3200	Дитмарская ранняя	Iju
Московская поздняя 15/репродукция     Московская поздняя		MoPo/MoPo1
Мечта F 1	Лангендейская зимняя	Mech
Номер первый грибовский 147	Дитмарская ранняя	N1
Парус/репродукция	Голландская группа	Par/Par4
Подарок 2500	Белорусская	Pod
Северянка F 1	Белорусская	Sev
Слава 1305	Слава	Sl13
Слава грибовская 231	Слава	Sl23
Стахановка 1513	Дитмарская ранняя Образцы var. sabauda L.	Sta
Вертю 1340	Вертю	Ver
Московская кружевница	Розеточная	MosKr
Юбилейная 2170	Ульмская Образцы var. capitata L. f. rubra	Ubi
Гако 741	Гако	Gak
Каменная головка 447	Эрфуртская	KamG
Рубин	Турновская	Rub
Краснокочанная линия I3	Эрфуртская	RedL1
Примечание. Репродукция -	- тот же образец, полученный из элитных семян.

При амплификации 21 микросателлитного локуса было получено 103 аллеля со средним числом 4,9 для каждого локуса. При этом для изученных образцов выявили 13 специфичных аллелей. Наибольшее число специфичных аллелей (семь) было найдено у образцов Северянка F1, Бело- русская 455, Подарок 2500, Амагер 611 и Зимовка 1474. Размеры продуктов амплификации варьировали от 130 до 410 п.н. Наиболее информативные SSR-локусы AF458409 и BZ523957 с индексом информативности для праймеров соответственно 0,90 и 0,86 были представлены пятью аллелями (рис. 1). Однако менее информативные SSR-локусы с PIC праймеров 0,69 могли содержать большое число аллелей — до 13, как у CC969431, или 11, как у CC956699, CC969507 и AF113918. Наименьшее значение PIC для праймеров локуса AF180355 было 0,30, где обнаружили всего 2 аллеля.

2. Полиморфные микросателлитные локусы, использованные для оценки генетических взаимосвязей между генотипами капусты кочанной ( Brassica oleracea L.) (коллекция ФГБНУ Федерального научного центра овощеводства)

Б

Рис. 1. Электрофореграммы продуктов ПЦР-амплификации микросателлитных локусов AF458409 (А) и BZ523957 (Б) у селекционных образцов капусты кочанной ( Brassica oleracea L.) (коллекция ФГБНУ Федерального научного центра овощеводства) . М — маркер молекулярных масс (GeneRuler100 bp plus DNA ladder, «Thermo Fisher Scientific», США). Расшифровку обозначений и описание образцов см. в таблице 1.

Название маркера в GenBank NCBI	Гены с полиморфными микросателлит-ными последовательностями	Мотив	Число аллелей	PIC
AF051772	Reproductive meristem gene 1 (REM1) mRNA	(gaa)5	3	0,81
AF051772(2)	B3 domain-containing protein REM1	(ct)6-1(ct)4-1(tcc)3	4	0,78
AF458409	Deoxycytidine deaminase (DCTD1), mRNA	(aga)6	5	0,90
AJ427337	mRNA for calmodulin 1 (cam1 gene)	(ga)5	3	0,61
BZ523957	Genomic clone BOKAH45	(ttg)6	5	0,86
СС956628	Brassica oleracea genomic clone BOIAA94,
	genomic survey sequence	(tc)5	2	0,50
CC956699	Brassica oleracea genomic clone BOIAB20,
	genomic survey sequence	(cac)9	11	0,69
CC969431	Genomic clone BOIAB19	(ga)6	13	0,61
CC969459	Genomic clone BOIAB94	(cgg)5	2	0,31
CC969497	Genomic clone BOIAA26	(tgc)5	2	0,83
CC969507	Genomic clone BOIAB15	(ct)5	11	0,74
Х94979	mRNA for pollen coat protein	(atg)5	2	0,44
AF241115	Isolate HRI/CGN 5688 cauliflower gene	(at)5(ta)6	6	0,51
X92955	mRNA for pollen coat protein	(tttta)2(ata)7	3	0,57
AF180355	Isolate B265 ABI1 protein (ABI1) gene	(tc)16	2	0,30
AF113919	Phospholipase D2 (PLD2) gene	(at)6(gt)5	3	0,58
AF273844	Thioredoxin-h-like protein 1 (THL1) mRNA	(ctt)7	4	0,73
AF230693	Stearoyl-ACP desaturase (DELTA9-BO-1) gene	(ctt)3(ct)6(cttg)6	4	0,81
AF113918	Phospholipase D1 (PLD1) gene	(ct)7(at)7-1	11	0,60
U67451	Brassica oleracea homeotic protein boi1AP1
	(Boi1AP1) mRNA	(at)9-1	6	0,81
AF241115(2)	Isolate HRI/CGN 5688 cauliflower gene	(ta)6-1	2	0,63

Рассчитанные данные для PIC в наших исследованиях согласуются со значениями, полученными для этих же маркеров другими авторами ( х ² = 2,16 при p = 1,0) (11, 12). Маркеры для локусов, которые при анализе показывали значение PIC >  0,5, оказались эффективными при генетической дискриминации родственных генотипов (25). В итоге у изученных образцов с помощью этого набора маркеров мы выявили 76 % полиморфизма.

Рис. 2. Структура изученной выборки селекционных образцов капусты кочанной ( Brassica oleracea L.) (коллекция ФГБНУ Федерального научного центра овощеводства) , полученная с использованием программы STRUCTURE на основании байесовского анализа по шести кластерам (K = 6). Расшифровку обозначений и описание образцов см. в таблице 1.

Рис. 3. UPGMA-дендрограмма генетического сходства между селекционными образцами капусты кочанной ( Brassica oleracea L.) (коллекция ФГБНУ Федерального научного центра овощеводства) , построенная на основе изменчивости микросателлитных локусов. Значения bootstrap получены для 1000 реплик. Расшифровку обозначений и описание образцов см. в таблице 1.

Результаты анализа данных в STRUCTURE показали, что все тестируемые образцы лучшим образом распределились по шести кластерам (AK = 2,05), где сгруппировались согласно происхождению (рис. 2). Подсчитанные генетические дистанции варьировали от 0,060 до 0,186, причем наибольшее генетическое расстояние было отмечено между сортом Парус и гибридом Мечта F1. Образцы капусты Северянка F1, Белорусская 455, Подарок 2500, Амагер 611 и Зимовка 1474 голландской группы с происхождением из Северо-Западной Европы объединились в общий кластер (рис. 3). Высокое генетическое сходство сортов Амагер 611, Белорусская 455 и Подарок 2500 подтверждает то, что последний был получен посредством сложной гибридизации двух первых. Относительно новый гибрид Северянка F1 с улучшенными показателями качества и устойчивости к фузариозному увяданию, киле и бактериозу был создан при участии сортов Белорусская 455, Зимовка 1474 и Подарок 2500, отселектированных на Грибовской опытной станции. Сорт Белорусская 455 имел происхождение из Витебской области и был получен с помощью отбора наиболее скороспелых форм и районирован с 1943 года. Районированный в том же году и обладающий высокой продуктивностью позднеспелый сорт Московская поздняя 15 находился в отдельном подкластере, ближе к более поздним по спелости образцам, что объясняет его местное происхождение из сорта Пышкинская (26). Генетическая отдаленность этого сорта также подтверждается его принадлежностью к отдельному сортотипу в Среднерусской группе сортов. Сорт Парус с высокими показателями качества образовывал свой отдельный кластер, что доказывает его генетическую отдаленность от общей группы сортов и сложное происхождение от различных линий с хозяйственно ценными свойствами.

Сорта сортотипа Дитмарская ранняя происхождением из Центральной Европы (Июньская 3200, Стахановка 1513, Номер первый грибовский 147 и скороспелый гибрид Аврора F 1 , имеющий в родословной сорт Июньская 3200) сгруппировались в отдельный кластер. Все эти образцы обладали скороспелостью. Сорт Номер первый грибовский 147, районированный с 1943 года, был использован для создания сорта Июньская 3200, что также согласуется с его расположением на дендрограмме. Линии, выведенные из гибрида Аврора F 1 , образовали отдельный подкластер. Такое их расположение подтверждает, что линейный материал из гибрида может быть достаточно отдален от него генетически. Выведенные на Грибовской опытной станции и районированные в 1940 году традиционные среднеспелые сорта Слава грибовская 231 и Слава 1305, представляющие сортотип Слава, находились в отдельном подкластере.

Новый гибрид Зарница F 1 среднераннего срока образовывал отдельную ветвь дендрограммы ближе к раннеспелым образцам, тогда как позднеспелый гибрид Мечта F 1 сформировал кластер, который находился на расстоянии 0,123 от общей группы капуст белокочанных.

В отдельный подкластер внутри кластера капуст белокочанных объединились сорта капусты савойской. Все они относились к разным сорто-типам, поэтому расположились генетически отдаленно друг от друга. Скороспелый сорт Юбилейная 2170 был получен в результате скрещивания капусты савойской Венская ранняя и сорта белокочанной капусты Номер первый 147. Новый сорт Московская кружевница среднераннего срока созревания с сильной пузырчатостью листа оказался наиболее генетически отдаленным от двух других сортов капусты савойской.

Традиционные сорта капусты краснокочанной Каменная головка 447 и Гако 741, выведенные на Грибовской опытной станции и районированные в 1943 году, относятся соответственно к сортотипам Эрфуртская и Гако, что подтверждается их генетической отдаленностью. В этом же кластере сгруппировались сорт Рубин и селекционная линия I3 424-17. Тради- ционные сорта хорошо адаптированы к местным условиям выращивания и представляют собой популяции, которые могут служить источниками генов для получения ценных линий, поскольку обладают генетической изменчивостью и пластичностью.

Нужно также отметить, что выведенные относительно недавно сорта Парус, Московская кружевница, гибриды Зарница F 1 и Мечта F 1 были достаточно отдалены от основных кластеров традиционных сортов. Кроме того, селекционные линии, выведенные из перспективных гибридов F 1 , в значительной мере отличались от изначальной формы, что позволяет контролировать процесс инбридинга при получении перспективных линий на основе гибрида с использованием ДНК маркеров.

В нашем исследовании относительно небольшой набор микросател-литных маркеров позволил классифицировать уникальные отечественные образцы капусты кочанной. В работе M.A. El-Esawi с соавт. (27) с использованием всего 12 микросателлитных локусов на 25 генотипах Brassica oleracea L., из которых 15 составляли капусты кочанные, было выявлено 75,7 % полиморфизма, что согласуется с полученными нами данными.

Несмотря на значительные достижения в генетике капустных культур, основные исследования, как правило, сконцентрированы на изучении устойчивости к патогенам (28-30), времени цветения (31, 32), морфологических показателей кочана (33), растрескивании кочана (34, 35), тогда как сведения по генетической идентификации сортов капусты кочанной, принадлежащих к различным группам спелости, практически отсутствуют. На основе генетической оценки изученных образцов мы выделили две основные группы генотипов капусты белокочанной: раннего срока созревания (кластер с образцами Аврора F 1 , Июньская, Номер первый грибовский 147, Стахановка 1513) и позднего срока созревания (Московская поздняя 15, Северянка F 1 , Белорусская 455, Амагер 611 и Зимовка 1474). Генотипы савойской разновидности в целом обладали большей скороспелостью, что может объяснить их близкое генетическое расположение к группе более скороспелых образцов. Из них сорт Вертю 1340 относился к наиболее позднеспелым с периодом созревания около 130 сут, тогда как поздние генотипы капусты белокочанной могут созревать более 140 сут.

В силу того, что морфологические признаки и характеристики известных сортов могут быть подвержены воздействию факторов внешней среды, которые вызывают фенотипическую изменчивость и делают оценку сортовых качеств затруднительной, ДНК маркеры оказываются единственным инструментом для точного определения, поддержания и сохранения необходимых для дальнейшей селекции генотипов (36). Селекционные образцы, принадлежащие к различным группам спелости и ценным отечественным сортотипам и пригодные для выращивания во всех регионах России, могут быть определены и отобраны на основании результатов ДНК-анализа с использованием набора известных SSR маркеров.

Таким образом, SSR маркеры показали эффективность в выявлении генетической изменчивости у 24 генотипов капусты кочанной, среди которых были близкие по происхождению и принадлежащие к одному сорто-типу. Результаты ДНК-анализа подтвердили все родственные связи среди традиционных сортов и новых гибридов. Следовательно, установленная генетическая основа изученных образцов может быть определяющей для возможных комбинационных скрещиваний при получении новых селекционных форм. Результаты SSR-анализа и данные о генетических дистанциях предоставляют информацию для отбора селекционного материала, контроля комбинаций среди форм различных групп спелости с признаками

èñõîäíûõ ñîðòîòèïîâ è âûäåëåíèÿ ñåëåêöèîííûõ ëèíèé, ïîëó÷åííûõ èç ãè-áðèäíûõ è/èëè ñîðòîâûõ ïîïóëÿöèé.

ËÈÒÅÐÀÒÓÐÀ

ФГБНУ Федеральный научный центр овощеводства ,         Поступила в редакцию

143080 Россия, Московская обё., Одищовский р-щ                      16 июля 2020 года

ïîñ. ÂÍÈÈÑÑÎÊ, óë. Ñåëåêöèîííàÿ, 14,

Sel’skokhozyaistvennaya biologiya [ Agricultural Biology ], 2020, V. 55, № 5, pp. 890-900

ASSESSMENT OF GENETIC DIVERSITY AMONG HEADED CABBAGE ( Brassica oleracea L.) ACCESSIONS BY USING SSR MARKERS

A.S. Domblides ^В , L.L. Bondareva, V.F. Pivovarov

The authors declare no conflict of interests Received July 16, 2020