Оценка генетического разнообразия в породах и экспериментальных популяциях кур с помощью ДНК-фингерпринтинга

Недостаточная изученность генетической структуры отдельных пород и экспериментальных популяций кур зачастую приводит к тому, что их генетическое разнообразие оказывается далеко не оптимальным. Мониторинг генетических процессов позволяет своевременно принимать меры по повышению внутрипопуляционного разнообразия, лучше понимать породообразовательный процесс, прогнозировать развитие пород и планировать селекционно-генетическую работу (1). Особое значение имеет оценка генетического разнообразия в малочисленных генофондных популяциях кур, которые представляют собой источник ценных для селекции комбинаций генов, утраченных в промышленных линиях и породах. Разведение генофондной птицы с учетом данных по средней гетерозиготности является способом сохранение генофонда, составляющего часть национальной культуры (2).

Проведенные в последние годы исследования указывают на высокую эффективность метода ДНК-фингерпринтинга при оценке генетического разнообразия в популяциях сельскохозяйственных животных (3-6). Несмотря на то что ДНК-фингерпринтинг рассматривается сейчас как наиболее эффективный метод изучения тотальных изменений генома (7) и генетической структуры популяций (2, 3, 5, 8), до сих пор не решен вопрос о том, каким образом возникает и поддерживается генетическое разнообразие по микро- и минисателлитным локусам. Во многих случаях полиморфизм объясняется неодинаковым числом копий повторяющейся единицы у разных индивидов (9, 10). Однако к концу 90-х годов были получены доказательства более сложного механизма появления новых аллелей, чем просто изменение числа тандемных повторов. Так, в 1997 году был изучен локус (СА) n, расположенный возле гена HLA-B человека на расстоянии 20 тыс. п.н. от центромеры. Секвенирование соответствующего участка показало, что мутационный процесс включал не только изменение числа СА-повторов, но и замены нуклеотидов в прилегающих последовательностях ДНК (11).

Одним из наиболее информативных молекулярных зондов при изучении распределения минисателлитной ДНК в геноме птицы являются олигонуклеотидные зонды (5). Подобные зонды использовали при изучении генетического разнообразия в 12 линиях и породах кур, включая инбредную линию, промышленные линии и аборигенные породы (12).

Основной целью нашей работы была оценка генетического разнообразия в породах и экспериментальных популяциях кур, разводимых в России, на основе использования молекулярного зонда (GTG)5.

Методика. Анализировали геномную ДНК, выделенную из крови кур пород Андалузская голубая, Черный австралорп и Полосатый плимутрок, а также экспериментальных популяций Черно-пестрый австралорп и Аврора. Образцы крови кур породы Андалузская голубая были любезно предоставлены сотрудниками Всероссийского научно-исследовательского и технологического института птицеводства (ГНУ ВНИTИП, г. Сергиев Посад), остальных популяций — сотрудниками экспериментального хозяйства Всероссийского НИИ генетики и разведения сельскохозяйственных животных (ВНИИГРЖ).

ДНК выделяли общепринятым методом с использованием протеиназы К и фенола и обрабатывали рестриктазой Bsu RI («Fermentas», Литва) в соответствии со стандартным протоколом. Электрофорез фрагментов рестрикции проводили в трис-боратном буфере (рН 8,3) и 0,8 % агарозном геле при напряжении 60 В около 2 сут. Одноцепочечную ДНК переносили на нейлоновый фильтр в специальной камере под давлением 80 мм рт. ст. в течение 1 ч. Зондом служил олигонуклеотид (GTG)5, меченный дезоксигенином. Места связывания зонда с геномной ДНК выявляли иммунохимическим методом с помощью набора реактивов фирмы «Roche» (Швейцария). Для документирования результатов и последующей компьютерной обработки получали изображение фильтра в цифровом формате с высоким разрешением, используя программу IPLab ™ . Детекцию и сравнение фрагментов ДНК проводили с помощью программы RFLPscan ™ . Основные популяционно-генетические параметры — число фрагментов ДНК на фильтре, число генетических локусов, коэффициент сходства ( BS) , среднюю гетерозиготность ( H — рассчитывали с помощью программы Gelstats ™ (13) по методикам разработчиков. Генетическое расстояние D между популяциями определяли по формуле, приведенной M. Lynch (14). Внутрипопуляционное генетическое разнообразие анализировали на основании расчетов средней гетерозиготности (15).

Результаты . Использование зонда (GTG)5 позволило выявить ряд гибридизационных фрагментов размером от 2000 до 23 000 п.н., равномерно распределенных по всей длине фильтра. Как известно, одним из наиболее важных показателей информативности ДНК-фингерпринтов является вероятность случайного совпадения распределения всех фрагментов ДНК в электрофоретических спектрах у двух особей (величина Р). Численно значение Р равно произведению вероятностей совпадения каждого фрагмента ДНК на фингерпринте (16). В наших экспериментах вероятность совпадения (Р) была очень низкой и у кур экспериментальной популяции Черно-пестрый авст-ралорп достигала величины 5,6 х 10^-1 , что свидетельствует о высокой информативности применения зонда (GTG)5 в сочетании с рестрик-тазой Bsu RI. Следует также отметить, что в некоторых работах удалось получить еще более низкие значения Р (12).

Интересным представляется выявление фрагментов ДНК, специфических (маркерных) для отдельных пород и экспериментальных популяций. Как оказалось, изученные нами группы птицы различались по частоте встречаемости гибридизационных фрагментов

*

ДНК. Отмеченная в некоторых случаях разница была очень значительной и позволяла говорить о наличии маркерных фрагментов. Так, для фингерпринтов образцов ДНК почти всех особей популяции Черно-пестрый австралорп и всех особей породы Полосатый плимутрок была характерна интенсивная, хорошо заметная и воспроизводимо повторяющаяся на разных фильтрах полоса фрагмента размером 4350 п.н. У кур исходной породы Черный австралорп полоса 4350 п.н. в спектрах рестрикции отмечалась лишь у отдельных особей и ее интенсивность была невысокой.

Созданная при участии двух пород — Черный австралорп и Полосатый плимутрок экспериментальная популяция Черно-пестрый австралорп долгое время разводилась «в себе», что привело к фенотипическим изменениям — фиксации определенной окраски оперения, а также, как показал генетический анализ, к изменениям в геноме. Экспериментальная популяция Аврора была получена из популяции Чернопестрый австралорп в результате селекции на повышение функциональных резервов надпочечников (17). Отличительной чертой этой птицы является то, что по голубому цвету оперения она сходна с курами породы Андалузская голубая.

При анализе ДНК-фингерпринтов было выявлено большое генетическое расстояние между породами Полосатый плимутрок и Черный австралорп ( D = 0,110), а также между породой Андалузская голубая и популяцией Аврора ( D = 0,155) (табл. 1). Такие относительно высокие значения генетического расстояния подтверждают неродственность сравниваемых групп птицы.

1. Генетические параметры в сравниваемых породах и экспериментальных популяциях кур, рассчитанные по данным анализа ДНК-фингерпринтов

Порода, популяция	n	Число полос на дорожку, X + m	P	BS w	BS b	D
Полосатый плимутрок	10	26,7 + 1,8	9,3 х 10-11	0,42	} 0,33	0,055
Черно-пестрый австралорп	9	24,6 + 1,8	5,6 х 10-12	0,35
Полосатый плимутрок	10	26,7 + 1,8	9,3 х 10-11	0,42	} 0,22
Черный австралорп	10	18,2 + 2,1	6,3 х 10-12	0,24		0,110
Черно-пестрый австралорп	9	24,6 + 1,8	5,6 х 10-12	0,35	} 0,25	0,045
Черный австралорп	10	18,2 + 2,1	6,3 х 10-12	0,24
Аврора	10	28,2 + 1,1	8,8 х 10-10	0,48	} 0,42	0,060
Черно-пестрый австралорп	10	28,0 + 2,6	1,2 х 10-9	0,48
Аврора	10	28,2 + 1,1	8,8 х 10-10	0,48	} 0,33	0,155
Андалузская голубая	10	32,9 + 1,5	8,7 х 10-11	0,49
Черно-пестрый австралорп	10	28,0 + 2,6	1,2 х 10-9	0,48	} 0,38	0,105
Андалузская голубая	10	32,9 + 1,5	8,7 х 10-11	0,49

П р и м е ч а н и е. P — вероятность совпадения спектров ДНК-гибридизации на фильтре у двух особей, BS w и BS b — коэффициент сходства соответственно внутри и между популяциями, D — генетическое расстояние (14).

Максимальное число аллелей, приходящихся на один локус, которое существенно превышало значения, полученные для других пород или популяций, обнаружили у породы Черный австралорп — 8,86 (табл. 2), наименьшее число аллелей на локус — 4,47 и среднюю гетерозиготность Н = 0,58 — у породы Андалузская голубая. Надо отметить, что средняя гетерозиготность зависит не только от числа аллелей на один локус, но и от числа выявленных в геноме локусов. Например, у породы Полосатый плимутрок число аллелей на локус оказалось существенно выше, чем в популяции Аврора (соответственно 6,39 и 5,21), в то время как средняя гетерозиготность была практически одинакова (соответственно 0,67 и 0,66).

Следовательно, в генофондных популяциях выявленная средняя гетерозиготность характеризуется сравнительно низкими значениями. Это легко объяснить тем, что при разведении птицы в ограниченных по численности группах инбридинга не избежать и, как следствие, происходит постоянное обеднение генофонда. При соответствующем молекулярном контроле в таких группах можно применять подбор, направленный на сохранение генетического разнообразия, что значительно сократит затраты, поскольку в этом случае нет необходимости содержать большое поголовье, и снизит потребность в его постоянном пополнении птицей из других популяций. Аналогичный вывод был сделан в более ранних исследованиях (18).

Полученные показатели средней гетерозиготности (см. табл. 2) указывали на высокое внутрипопуляционное генетическое разнообразие в породе Черный австралорп ( Н = 0,75) и хорошо согласовывались с низким значением коэффициента внутрипопуляционного сходства для этой породы ( BS _w = 0,24) (см. табл.1).

2. Средняя гетерозиготность в сравниваемых породах и экспериментальных популяциях кур, рассчитанная по данным анализа ДНК-фингерпринтов

Порода, популяция	Число	Н *	Н **	Н ***
	локусов    аллелей на локус

Полосатый плимутрок	12,72	6,39	0,67	0,76	0,72
Черно-пестрый австралорп	14,48	5,46	0,62	0,72	0,67
Черный австралорп	10,39	8,86	0,75	0,84	0,80
Андалузская голубая	20,81	4,47	0,58	0,68	0,63
Аврора	15,19	5,21	0,66	0,76	0,71
*, ** и *** — соответственно средняя гетерозиготность, скорректированное значение гетерозиготности и гетерозиготность по L. Jin и R. Chakraborty. Показатели рассчитаны с использованием программы Gelstats ™ (13, 15).

Таким образом, с помощью метода фингерпринтинга фрагментов рестрикции ДНК проведена количественная оценка генетического разнообразия в некоторых популяциях кур (породы и экспериментальные популяции) из коллекционария Всероссийского НИИ генетики и разведения сельскохозяйственных животных. Отмечена высокая информативность ДНК-фингерпринтов. Обнаружен специфичный для экспериментальной популяции Черно-пестрый австралорп фрагмент размером 4350 п.н. Показаны высокие значения генетических расстояний между неродственными популяциями Черный австралорп и Полосатый плимутрок, а также Андалузская голубая и Аврора. Генетический мониторинг позволяет определять происхождение популяций и оценивать влияние проводимой селекции на их структуру. Подтвержден факт быстрой дивергенции сходных популяций при направленной селекции по определенным признакам. Выявленные маркерные фрагменты ДНК могут служить инструментом при анализе результатов скрещивания в птицеводстве.

Л И Т Е Р А Т У Р А

• 1.    Т ы щ е н к о В.И., Д е м е н т ь е в а Н.В., Т е р л е ц к и й В.П. и др. Оценка генетического разнообразия в популяциях кур на основе геномной дактилоскопии. С.-х. биол., 2002, 6: 43-46.

• 2.   М о и с е е в а И.Г., Л и с и ч к и н а М.Г. Домашние куры: мифология, традиции, обычаи, народное творчество. Друг, 1997, 1: 22-25.

• 3.   С е м е н о в а С.К., Ф и л е н к о А.Л., В а с и л ь е в В.А. и др. Использование полиморфных маркеров ДНК для идентификации пород кур различного происхожде

  ния. Генетика, 1996, 32(5): 795-803.

• 4.    П е т р о с я н В.Г., Т о к а р с к а я О.И., К а ш е н ц е в а Т.А. и др. Оценка подразделенности популяций на основе данных ДНК-фингерпринтинга и модифицированной Fst-статистики Райта. Генетика, 2003, 39(2): 229-235.

• 5.    Р ы с к о в А.П. Мультилокусный ДНК-фингерпринтинг в генетико-популяционных исследованиях биоразнообразия. Мол. биол., 1999, 33(6): 997-1011.

• 6.   W e i g e n d S., R o m a n o v M.N. Current strategies for the assessment and evaluation of genetic diversity in chicken resources. World’s Poultry Sci., 2001, 3: 275-288.

• 7.   М а р т и р о с я н И.А., К а н Н.Г., П е т р о с я н В.Г. и др. Фингерпринтный анализ вариабельности мини- и микросателлитных повторов ДНК у партеногенетиче

  ских ящериц Daverskia armenica . Генетика, 2003, 39(2): 215-222.

• 8.    Ш а б р о в а Е.В., Т а р с к а я Л.А., М и к у л и ч А.И. и др. Дифференциация близкородственных и отдаленных популяций человека на основе данных мультило-кусного ДНК-фингерпринтинга. Генетика, 2003, 39(2): 236-243.

• 9.    Р ы с к о в А.П., Д ж и н ч а р а д з е А.Г., П р о с н я к М.И. и др. Геномная «дактилоскопия» организмов различных таксономических групп: использование в качестве гибридизационной пробы ДНК фага М13. Генетика, 1988, 24(2): 227-238.

• 10.    Ч у р к и н а И.В., С а з а н о в А.А., Ч е р е п а н о в С.В. и др. Использование пробы pGB725, содержащей поли-TG-повторы, для выявления полиморфных микроса-теллитных локусов в геноме курицы Gallus gallus domesticus . Генетика, 1995, 31(9): 1189-1193.

• 11.  G r i m a l d i M.C., C r o u a u - R o y B. Microsatellite allelic homoplasy due to variable flanking sequences. J. Mol. Evol., 1997, 44: 336-340.

• 12.  P o n s u k s i l i S., W i m m e r s K., H o r s t P. Evaluation of genetic variation within and between different chicken lines by DNA fingerprinting. J. Heredity, 1998, 89: 17-23.

• 13.  R o g s t a d S.H., P e l i c a n S. GELSTATS: a computer program for population genetics analysis using VNTR multilocus probe data. BioTechniques, 1996, 21: 1128-1131.

• 14.  L y n c h M. Analysis of population genetic structure by DNA fingerprinting. In: DNA fingerprinting: approaches and applications. Basel, 1991: 113-126.

• 15.  S t e p h e n s J.C., G i l b e r t D.A., Y u h k i N. e.a. Estimation of heterozygosity for single-probe multilocus DNA fingerprints. Mol. Biol. Evol., 1992, 9: 729-743.

• 16.  J e f f r e y s A.J., W i l s o n V., K e l l y R. Mouse DNA fingerprints analysis of chromosome localization and germ-line stability of hypervariable loci in recombinant inbred

  strains. Nucl. Acids Res., 1987, 15: 2823-2836.

• 17.    Д м и т р и е в В.Б., Ч у р к и н а И.В., С м и р н о в А.Ф. и др. Дестабилизирующий эффект отбора кур по функциональным резервам надпочечников. Генетика, 2001, 37(4): 517-523.

• 18.    Д е м е н т ь е в а Н.В. Оценка полиморфизма минисателлитных ДНК у коров, кур и осетровых рыб. Автореф. канд. дис. СПб-Пушкин, 1996.

  Поступила в  редакцию

  31 января 2007 года

  
  

  ГНУ Всероссийский НИИ генетики и разведения сельскохозяйственных животных Россельхозакадемии , 196625 г. С.-Петербург-Пушкин, Московское ш., 55а, e-mai l: afyakov@mail.ru

ESTIMATION OF GENETIC VARIABILITY IN THE BREEDS AND HEN EXPERIMENTAL POPULATIONS BY DNA-FINGERPRINTING

V.I. Tyshchenko, O.V. Mitrofanova, N.V. Dement’eva, V.P. Terletskii, A.F. Yakovlev

S u m m a r y

By the DNA-fingerprinting method with using of (GTG)5 sonde the genetic variability was investigated in the breeds (striped Plymouth Rock, Andalucian blue, black Austra-lorp) and hen experimental populations (black-and-white Australorp and Aurora). The high informativity of DNA-fingerprintings was marked. The DNA fragment of 4350 bp length specific for the experimental population black-and-white Australorp was detected. The high values of genetic distances between unrelated populations (black Australorp and striped Plymouth Rock, Andalucian blue and Aurora) were shown. The authors have confirmed the fact of rapid divergence of similar populations at the directed selection on certain determinants.