Оценка генов BLTF, BGH и BPRL у коров татарстанского типа на резистентность к маститу

Во всех странах мира с интенсивным молочным скотоводством большую хозяйственно-экономическую проблему представляет собой воспаление молочной железы - мастит. Мастит, остается одним из наиболее распространенных болезней вымени, несмотря на широкое внедрение в машинное доение коров современных технологий, профилактирующих это заболевание [7]. она причиняет животноводству большие убытки за счет снижения молочной продуктивности, уменьшения срока хозяйственного использования коров и снижения санитарно-технологического качества молока и молочной продукции, fl; 2; 4]. Проблема качества молока стала особенно актуальной после вступления России в Таможенный союз, ВТО и принятия Технического регламента Таможенного союза "О безопасности молока и молочной продукции” ТР ТС 033/2013 [5; 8]. С целью получения безопасной, биологически ценной и конкурентоспособной молочной продукцией были ужесточены требования к молоку по таким показателям, как количество соматических клеток и бактерий, наличие ингибирующих веществ и патогенной микрофлоры. Для успешного введения селекционно - племенной работы в условиях интенсификации производства и возрастающей конкуренции на рынке молочной продукции путем повышения качественных и количественных показателей основного сырья - молока, возникает потребность в дополнении классической селекции методами молекулярно-генетического генотипирования, которые помогут более объективно выявить животных рези стентных болезням вымени и обладающих повышенными производственно-технологическими свойствами молока.

В настоящее время из известных генетических маркеров в качестве потенциальных маркеров резистентности к маститу могут рассматриваться гены лактоферрина (bLTF), пролактина (bPRL) и частично соматотропина (bGH).

Лактоферрин - принадлежит к семейству железосодержащих и является многофункциональным малым гликопротеином молока. Существуют данные о том, что он опосредованно вовлечен в процессы клеточного иммунитета и его основная функция — защита молочной железы. В связи с этим вероятна ассоциация полиморфных вариантов гена bPRL с резистентностью к маститам [10; 11].

Пролактин - выполняет очень важные регуляторные функции в процессах дифференцировки эпителиальных клеток молочной железы, лактогенеза и лактации. Анализ отмеченных функций пролактина дает основание предполагать, что этот гормон может служить потенциальным генетическим маркером молочной продуктивности, а как следствие и дополнительным критерием оценки иммунной системы молочной железы [6; 9]. Соматотропин -гормон роста является многофункциональным регулирующим полипептидом, обладающий ростостимулирующей активностью. Безусловно, он необходим, для постнатального роста и для нормализации углеводного, липидного, азотного и минерального обмена.

Установлена связь различных полиморфных вариантов гена bGH с такими хозяйственно-полезными признаками крупного рогатого скота как рост и развитие, молочная продуктивность (удой, содержание жира и белка в молоке [3].

Материалы и методы исследований. Исследования проводили в племенном заводе «Бирюли» Высокогорского района Республики Татарстан. Для определения полиморфизма генов bLTF, bGH и bPRL и установления резистентности к маститу, было отобрано 25 коров татарстанского типа, из них 13 были больны маститом и 12 здоровы, при чем они при жизни не болели маститом.Кровь для выделения ДНК отбирали из подхвостовой вены в объёме 5 мл в вакуумные пробирки с сухим ЭДТА КЗ (ООО «ГЕМ», Россия). Геномную ДНК животных выделяли из 200 мкл цельной крови с использованием набора реагентов. ПЦР проводили на программируемом термоциклере «Терцик» (Россия) в объеме 20 мкл, содержащей буфер (60 мМ трис-НС1 (pH 8,5), 1,5 мМ MgCl₂, 25 мМ КС1, 10 мМ меркаптоэталол; 0,1 мМ тритон Х-100). Визуализации фрагментов ДНК проводили путем горизонтального электрофореза при 15 В/см в течение 40 мин в НТВЕ буфере. После электрофореза гель просматривали в УФ-трансиллюминаторе при длине волны 310 нм. Идентификацию генотипов определяли по количественным и качественным признакам ПЦР-НДРФ. Анализ локуса гена лактоферрина проводили по праймерам LTF-F: 5"'-GCCTCATGACAACTCCCACAC-3' и LTF-R: 5'-CAGGTTGACACATCGGTTGAC-3^/ предложенных Seyfert Н.М., Kuhn С., (1994), путем амплификации фрагмента гена лактоферрина длиной 301 пары нуклеотидов.

Анализ гена пролактина проводили по праймерам PRL1: 5-CGA GTC СТТ ATG AGC 1TG АТТ СТЕЗ7 и PRL2: 5'-GCC 1ТС CAG AAG TCG ТП GIT TTC-3', сконструированных А. Dybus (2002) путем амплификации фрагмента гена пролактина длиной 156 пары нуклеотидов. Анализ гена соматотропина проводили по праймерам GH5F: 5 -GCT GCT OCT GAG GGC ССТ ТС-3 и праймерам GH5R: 5Z-CAT GAC ССТ CAG GT А СОТ СТС CG-3, сконструированных D.F. Gordon et al. (1983) для амплификации фрагмента гена соматотропина длиной 211 пары нуклеотидов. Частоту генотипов лактоферрина, пролактина и соматотропина определяли по формуле определяли по формуле: р = n / N, где п -число особей, имеющих определенный генотип. N - общее число особей в популяции. Частоту отдельных аллелей определяли по формулам: рА = (2nAA+nAB) / 2N и q^ = (2nBB+nAB) / 2N, где рА - частота аллеля -А. qB - частота аллеля - В. N - общее число аллелей. Ожидаемую частоту генотипов в исследуемой популяции вычисляли ио закону Харди-Вайнберга. Оценку соответствия фактического (Ф) и теоретического распределения генотипов проводили по критерию согласия Пирсона - %2.

Результаты исследований. У коров татарстанского типа локус лактоферрина обладал средним уровнем полиморфизма со значительным преобладанием аллеля А - 0,7, частота другого аллеля В составила 0,3 (табл. 1). В исследованной группе коров из возможных трех генотипов выявлены лишь два: АА и АВ, генотип ВВ не обнаружен, что возможно объясняется небольшим числом исследованных животных -25 голов. Тем не менее группа коров находилась в генетическом равновесии, %² не превышал значения 3,09 (Р > 0,05).

Таблица 1 - Частота генотипов и аллелей лактоферрина у коров

Сравнительное изучение частоты генотипов локуса bLTF у здоровых и больных маститом коров показала, что достоверных различий между ними по этому показателю не наблюдается. Однако, сле дует отметить наличие определенной тенденции повышения частоты В аллеля и гетерозигот АВ на 24 %. Возможно присутствие В - аллеля в генотипе животных способствует их устойчивости к маститу.

Таблица 2 - Частота генотипов и аллелей пролактина у коров

Локус пролактина обладал аналогичным с лактоферрином уровнем полиморфизма, у этого гормона также преобладающим аллелем был А с частотой 0.78, а аллель В имел частоту значительно ниже -0,22 (табл. 2). У пролактина в отличии от лактоферрина обнаружены все три генотипа: АА. В В и АВ. Коровы по этим генотипам находились в генетическом равновесии, %2 не превышал значение 4.29. По локусу bPRL в отличии от лактоферрина, выявлены более значительные различия между здоровыми и больными маститом животными по частоте генотипов. В этом отношении преимуществом обладал гомозиготный генотип АА, его частота была в 1,8 разы выше, чем у больных коров (46,2%), а частота гетерозигот АВ снизилась в 5,5 раза. Также значительные различия между данными группами коров свидетельствует о том, что генотип АА пролактина обуславливает устойчивость коров к маститу. Локус соматотропина в отличии от двух предыдущих локусов обладал наименьшей степенью полиморфизма. По данному локусу коровы имели преимущественно гомозиготных генотип LL (92%), лишь у 2-х коров обнаружен гетерозиготный генотип LV (8%). а гомозиготный генотип W вовсе не выявлен (табл. 3). Поэтому очень трудно судить о наличии какой-либо связи генотипов соматотропина с устойчивостью коров к маститу. Кроме того, различия между здоровыми и больными животными по частоте преобладающего генотипа LL оказались менее ^ значительными, соответственно 100 и 84,6 %.

Табл ица 3 - Частота ген оти пов и аллелей соматотропина у коров

Заключение. Таким образом, у коров татарстанского типа все три исследованных локуса белков оказались полиморфными: из них локусы в LTF и в PRL обладали средним уровнем полиморфизма, а в GH - низким. О возможной связи этих локусов с устойчивостью к маститу7 можно говорить лишь в отношении одного локуса - пролактина, по которому выявлены значительные различия между здоровыми и больными животными по частоте генотипов АА и АВ.