Оценка клеточной гибели при воздействии ксенобиотика на клетки костного мозга птиц и мышей

Введение. По итогам анализа антропогенных нагрузок в административных районах Красноярского края условно делят их на 5 групп территорий, характеризующихся определенными категориями экологического состояния окружающей природной среды. Особенно выделяется критическое состояние в 9 административных районах Красноярского края: Ачинский, Березовский, Емель-яновский, Канский, Назаровский, Рыбинский, Ужурский, Уярский, Шарыповский.

В Канске и прилегающих поселках установлено превышение ПДК выброса вредных веществ. В почве обнаружено повышенное содержание меди, сульфатов, нефтепродуктов, формальдегида, хлоридов железа, марганца, цинка, фенолов.

Тяжелые металлы занимают второе место по степени опасности для животных и птиц, уступая пестицидам. При внедрении в организм вредные вещества нарушают физиологические процессы в макроорганизме и приводят к активной форме гибели клетки – апоптозу [1, 2].

Цель и задача исследований . Целью настоящей работы явилось изучение воздействия ксенобиотика на клетки костного мозга птиц и мышей, содержащихся на территории Канского района. В задачу входило изучение влияния сульфата цинка на клетки костного мозга и проведение коррекции отрицательного влияния ксенобиотика растительным энтеросорбентом ЭБК-2 [3].

Материалы и методы исследований . Нами проведены 2 серии опытов по воздействию сульфата цинка на клетки костного мозга экспериментальных животных и птиц. Работа проведена на белых мышах массой 22–24 г (n = 16 и n = 15) и петушках 30-суточного возраста кросса Родонит-2 (n = 16 и n = 15) массой 288–300 г.

В первой серии опыта проводили оценку цитогенетических нарушений в клетках костного мозга при введении сульфата цинка в дозе 20 мг/кг массы тела в физиологическом растворе в течение 24 ч, 5 и 10 сут (табл. 1).

Первая серия опыта

Таблица 1

Экспериментальные животные	Группа
	1-я опытная	2-я опытная	3-я опытная	Контрольная
Белые мыши (n = 16)	Внутрибрюшинно сульфат цинка в дозе 20 мг/кг массы тела в течение суток	Внутрибрюшинно сульфат цинка в дозе 20 мг/кг массы тела ежедневно в течение 5 дней	Внутрибрюшинно сульфат цинка в дозе 20 мг/кг массы тела ежедневно в течение 10 дней	Внутрибрюшинно физиологический раствор в течение эксперимента
Цыплята кросса Родонит-2(n = 16)	Внутривенно сульфат цинка в дозе 20 мг/кг массы тела в течение суток	Внутривенно сульфат цинка в дозе 20 мг/кг массы тела ежедневно в течение 5 дней	Внутривенно сульфат цинка в дозе 20 мг/кг массы тела ежедневно в течение 10 дней	Внутривенно физиологический раствор в течение эксперимента

Процесс клеточной гибели наблюдали с помощью световой микроскопии, при этом анализу были подвергнуты по 400 клеток мазков костного мозга мышей и птиц, окрашенных по Папенгейму. Морфологические признаки апоптоза различали по уменьшению размеров клеток [4], морфологические признаки некроза – разрушение клеточных мембран, набухание и лизис клеток. Отдельно подсчитывали клетки в состоянии блеббинга (пузыреподобные выпячивания на клеточной поверхности) [5].

Математическую обработку полученных данных проводили на персональном компьютере с использованием стандартной программы фирмы Microsoft Excel. Степень и достоверность полученных экспериментальных данных определяли с помощью критериев Стьюдента.

Результаты исследований и их обсуждение . Данные первой серии эксперимента на мышах показали, что 24-часовое воздействие сульфата цинка не привело к значительному росту количества апоптозных клеток в костном мозге - 1,24 ± 0,14 % (контроль 1,06 ± 0,16 %), а также клеток в состоянии блеббинга - 2,18 ± 0,12 % (контроль 1,9 ± 0,23 %), тогда как 5-дневный курс введения мышам сульфата цинка влияет лишь на развитие блеббинга плазматической мембраны - 4,4 ± 0,52 и 1,90 ± 0,23 % в опытной и контрольной группах соответственно (Р <  0,001).

10-дневная затравка мышей ксенобиотиком привела к увеличению клеток в состоянии апоптоза по сравнению с исходным уровнем. Кроме того, количество пузыреподобных выпячиваний на поверхности клеток значительно повысилось (5,65 ± 0,64 и 1,90 ± 0,23 % в опыте и контроле соответственно, Р <  0,001). Число некротических клеток повышалось во всех опытных группах с проявлением прямой зависимости «время-эффект»: 24 ч - 0,31 ± 0,19 %; 5 сут - 0,55 ± 0,15; P < 0,05, и 10 суток - 0,75 ± 0,25 %, Р< 0,05, по сравнению с контролем 0,31 ± 0,19 %.

Данные первой серии наших экспериментов с петушками 30-суточного возраста показали, что 24-часовое воздействие ксенобиотика привело к незначительному росту количества апоптозных клеток в костном мозге - 1,14 ± 0,17 % (контроль 0,96 ± 0,13 %), а число клеток в состоянии блеббинга увеличилось - 3,01 ± 0,12 % (контроль 1,78 ± 0,13 %). Пятидневный курс введения цыплятам сульфата цинка приводил к увеличению клеток костного мозга в состоянии блеббинга плазматической мембраны в 1,5 раза и в состоянии апоптоза - в 2 раза.

Введение цыплятам сульфата цинка в течение 10 сут приводило к увеличению количества клеток в состоянии апоптоза и блеббинга по сравнению с исходным уровнем соответственно (3,2 ± 0,18 и 0,96 ± 0,13 %; 6,15 ± 0,24 и 1,78 ± 0,13 %).

Число некротических клеток повышалось во всех опытных группах с проявлением прямой зависимости от дней введения ксенобиотика: 24 ч - 0,61 ± 0,19 %; 5 сут - 0,85 ± 0,19 %, Р<0,05, и 10 сут - 1,15 ± 0,35 %, Р < 0,05, по сравнению с контролем 0,61 ± 0,19 %.

Оценивая динамику соотношения видов клеточной гибели у мышей и цыплят, мы выявили, что количество клеток с признаками апоптоза преобладает над количеством некротизированных клеток в 5 раз у животных контрольной группы. При увеличении времени воздействия ксенобиотика (24 ч, 5 сут) процент клеток в состоянии апоптоза несколько снижался, преобладая над некрозом в 4 раза. К 10-м суткам исследования увеличивался процент некротических клеток, хотя процент клеток с морфологическими признаками апоптоза был выше в 2 раза.

Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что сульфат цинка в дозе 20 мг/кг массы тела способен воспроизводить апоптоз и некроз в клетках костного мозга мышей и цыплят.

Во второй серии опыта были сформированы 2 опытные и контрольная группы. В 1-й опытной группе однократно вводили сульфат цинка в дозе 40 мг/кг; во 2-й опытной группе одновременно вводили сульфат цинка в дозе 40 мг/кг и растительный энтеросорбент в дозе 0,1 мг/кг живой массы с кормом (табл. 2).

Таблица 2 Вторая серия опыта

Экспериментальные животные / период исследования	Группа
	1-я опытная	2-я опытная	Контрольная
1	2	3	4
Белые мыши (n = 15) / 24 ч, 5 сут, 10 сут	Внутрибрюшинно сульфат цинка в дозе 40 мг/кг массы тела однократно	Внутрибрюшинно сульфат цинка в дозе 40 мг/кг массы тела однократно и с кормом раститель-	Внутрибрюшиннофизиологический раствор однократно

ный энтеросорбент ЭБК-2 в дозе 0,1 мг/кг живой массы

Окончание табл. 2

1	2	3	4
Цыплята кросса Родонит-2 (n = 15) /24 ч, 5 сут, 10 сут	Внутривенно сульфат цинка в дозе 40 мг/кг массы тела однократно	Внутривенно сульфат цинка в дозе 40 мг/кг массы тела однократно и с кормом растительный энтеросорбент ЭБК-2 в дозе 0,1 мг/кг живой массы	Внутривенно физиологический раствор однократно

Таблица 3

Поражения в клетках костного мозга в восстановительном периоде

Серия	Блеббинг, %		Апоптоз, %		Некроз, %
	Мыши	Цыплята	Мыши	Цыплята	Мыши	Цыплята
Контроль	1,9 ± 0,23	1,78 ± 0,13	1,06 ± 0,16	0,96 ± 0,13	0,31 ± 0,19	0,61 ± 0,19
Через 24 ч	2,88 ± 0,12**	2,97 ± 0,12**	1,28 ± 0,04*	1,78 ± 0,12**	1,30 ± 0,06**	1,56 ± 0,12**
Через 5 сут	2,60 ± 0,22**	2,1 ± 0,22**	1,24 ± 0,06*	1,40 ± 0,22**	1,85 ± 0,06**	1,24 ± 0,22**
Через 10 сут	1,80 ± 0,26	1,65 ± 0,26	1,04 ± 0,12	1,1 ± 0,26	0,38 ± 0,05**	0,92 ± 0,26

Примечание . Уровень достоверности по отношению к контролю: *P≤0,01, **P≤0,05.

Заключение. Как видно из таблицы 3, после однократного применения сульфата цинка через 5 сут количество клеток, особенно в состоянии некроза, увеличилось по сравнению с контролем, а к 10-м суткам эти показатели снизились до нормы. Это говорит о способности макроорганизма восстанавливаться после воздействия негативных факторов внешней среды.