Оценка мутагенной активности биопрепарата на основе молочнокислых и пропионовокислых микроорганизмов в условиях in vitro

В настоящее время из значительного количества изучаемых биологических объектов, особое внимание уделяется молочнокислым и пропионовокислым микроорганизмам. Интерес исследователей к ним связан с тем, что они являются продуцентами хозяйственно ценных биологически активных соединений, обладают выраженным антагонистическим эффектом в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов и способностью к активному росту и размножению [3, 9]. Использование пробиотических микроорганизмов уменьшает патологические расстройства желудочно-кишечного тракта при использовании антибактериальных средств. Пробиотики способны улучшать иммунную систему, функцию эпителиального барьера и производить антибактериальные факторы. Поэтому в настоящее время молочнокислые и пропионовокислые микроорганизмы в составе препаратов широко применяются в различных отраслях промышленности и сельского хозяйства [6, 7]. Тем не менее, согласно ЕАБП, ВОП и ВОЗ применение препаратов на основе таких микроорганизмов должно базироваться на их эффективности и безопасности [10].

В различных отраслях производства для оценки мутагенной активности широко применяется более 100 тест-систем [1]. Тем не менее, до настоящего времени не существует универсальных тест-систем, выявляющих главные типы генетических повреждений. В работе по выявлению и оценке мутагенных свойств изучаемых агентов используется целый комплекс, батареи тестов, которые взаимодополняют друг друга и отличаются по уровню биологической организации объекта исследования (прокариоты, эукариоты, системы in vitro, in vivo) или по конечному действию (повреждение ДНК, генные мутации, хромосомные аберрации, и др.). При этом последовательность испытаний препаратов проводят от простых к сложным тест-системам и от кратких опытов к более длительным [5]. Применяемые тест-системы должны быть легко воспроизводимыми и обладать существенной пропускной способностью.

Целью данной работы была оценка мутагенной активности нового биопрепарата на основе молочнокислых и пропионовокислых микроорганизмов в условиях in vitro.

Материал и методы исследований. Работа проводилась на базе лаборатории пробиотических препаратов и ферментов ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности. Объектом исследования являлся новый биопрепарат на основе штаммов молочнокислых (Lactobacillus plantarum, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus bucheri, Lactococcus lactis) и пропионовокислых микроорганизмов (Propionibacterium freudenreichii), который предполагается применять для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний сельскохозяйственных животных.

Определение мутагенной активности препарата на основе молочнокислых и пропионовокислых микроорганизмов методом оценки индукции генных мутации осуществлялось стандартным тестом Эймса с применением микроорганизмов [2, 5]. В качестве тестерных микроорганизмов применили штаммы Salmonella typhimurium ТА98 и TA100, предоставленные научнообразовательным центром фармацевтики Казанского (Приволжского) федерального университета.

В эксперименте, биопрепарат разводили основой препарата в агаризованной среде до концентрации (1,4-1,6)×109 КОЕ/мл. В пробирки, содержащие по 3 мл 0,6 % полужидкого «верхнего» агара с микродобавками биотина и гистидина и нагретые на водяной бане до температуры 45 ºС, добавляли 0,1 мл суспензии бактерии и 0,1 мл тестируемого образца. Содержимое пробирок быстро перемешивали и наслаивали на слой 1,5 % селективного «нижнего» агара в чашки Петри. После полного застывания слоя «верхнего» агара чашки переносили инкубироваться в термостат при 37 оС. Положительными контролями, индуцирующими мутации у тест-штаммов, служили прямые мутагены – 2-нитрофлуорен (2 мкг на пробу) для ТА 98, азид натрия (4 мкг на пробу) для ТА 100. Общий контроль (0,1 мл основа лечебного препарата) ставили на обоих штаммах в пяти повторностях, остальные пробы испытывали в трех повторностях. Мутагенный эффект препарата устанавливали через 48 ч совместной инкубации метаболитов с бактериальной культурой. Сравнивали количество колоний ревертантов в опытных и контрольных вариантах (колониеобразующие единицы КОЕ).

Мутагенность биопрепарата выражали через значения МИ (мутагенный индекс) – отношение количества колоний-ревертантов His+ в опыте (среднее число колоний на чашках с препаратом) к контролю (среднее число колоний на чашках с основой препарата). За присутствие мутагенного действия принимали превышение значения МИ, равный 2,0 и более для штамма бактерий ТА 98 и 1,8 и более для штамма ТА100. Превышение величины МИ от 2 (1,8) до 10 принимали как слабый, от 10 до 100 – как средний, от 100 и более – сильный мутагенный эффект тестируемого препарата [2].

Для определения цитотоксического эффекта препарата в отношении культур тестерных штаммов S. typhimurium ТА98, ТА100 в пробирки, содержащие 2,0 мл 0,6%-ого расплавленного полуобогащенного агара, добавляли по 0,1 мл суспензий штаммов бактерий в количестве 2×109 КОЕ/мл и по 0,1 мл препарата в исследуемой дозе. В контрольные пробы вместо исследуемого препарата вносили по 0,1 мл основы препарата. После полного застывания L-агара полученную смесь наслаивали на его поверхность и через 48 ч инкубирования в термостате при 37 оС осуществляли учет выросших колоний штаммов бактерий S. typhimurium.

Полученные в ходе исследования результаты обрабатывали методом вариационной статистики. Для каждой выборки устанавливали среднее арифметическое (Х), ошибку среднего арифметического (m). Проверку на нормальность распределения осуществляли с использованием критерия Шапиро–Уилка. Сравнение выборочных средних проводили по t-критерию Стьюдента в случае нормального распределения или по критерию Крускалла-Уоллиса для к-несвязанных выборок (к>2) в случае распределения, отличающегося от нормального. Различия считали достоверными при р< 0,05.

Результат исследований.

Микроорганизмы входят в состав различных тест-систем для определения мутагенной активности препаратов, химических соединений и их метаболитов. Доказано, что наиболее удобными и пригодными объектами для исследования мутаций являются бактерии, поскольку они способны делится быстро, вследствие чего их число можно многократно увеличить, регистрировать и получать результаты в течение нескольких часов.

В связи с вышеизложенным, оценку мутагенной активности разрабатываемого нами препарата на основе штаммов пробиотических микроорганизмов для профилактики и лечения желудочнокишечных заболеваний сельскохозяйственных животных проводили с применением мутационного теста на Salmonella typhimurium (тест Эймса). Метод был выбран нами в качестве недорогого, быстрого, простого и удобного анализа для оценки потенциала мутагенности препарата. Следует отметить, что данный тест имеет высокую корреляцию с канцерогенными свойствами веществ или препаратов [8]. Сущность этого метода заключается в том, что индикаторные штаммы бактерий Salmonella typhimurium, несущие генные мутации в гистидиновом опероне (у которых произошла мутация от ауксотрофности по гистидину к прототрофности) выращивают на специальной среде, на которой могут расти только мутанты данных штаммов.

С целью выявления разных типов мутаций в работе использовали мутантные штаммы S. typhimurium, имеющие следующие генетические характеристики [2]: ТА 100 – his G46, rfa, uvr-, pKm 101, bio; ТА 98 - his D3052, rfa, uvr-, pKm 101, bio-.

Штамм ТА98 регистрирует мутации типа сдвига рамки считывания, ТА100 – типа замены пар оснований в молекуле ДНК. Штаммы ТА100 и ТА98 несут дополнительно плазмиду устойчивости к ампициллину pKm 101, а также ген umu C, что повышает вклад ошибочной репарации в процесс мутагенеза, и, таким образом, чувствительность штаммов.

Поскольку для определения мутагенности препарата требуется изучение мутагенной активности в нетоксических концентрациях для микроорганизмов, проводилась оценка токсичности препарата по отношению к Salmonella typhimurium. Результаты исследований показали, что биопрепарат (титр 1,4-1,6 × 10⁹ КОЕ/мл) не проявляет цитотоксического действия на штаммы Salmonella typhimurium TA98, TA100. Ранее методами МТТ-теста, окрашивания трипановым синим и световой микроскопией, нами было показано отсутствие цитотоксичности штаммов молочнокислых и пропионовокислых бактерий изучаемого препарата после его инкубации с линиями клеток млекопитающих [4].

Результаты оценки индукции обратных мутаций в клетках S.typhimurium к гистидиновой прототрофности через 48 часов инкубации в присутствии биопрепарата и его основы (негативный контроль) показали, что варианты опыта достоверно не отличались (р>0,05) от отрицательных контрольных вариантов (Рисунок 1).

Изучаемый препарат и его метаболиты не вызывали индукцию обратных мутации от ауксотрофности по гистидину к прототрофности у гистидин-зависимых штаммов Salmonella typhimurium TA98 и TA100. Положительными контролями, индуцирующими мутации у тест-штаммов, служили прямые мутагены 2-нитрофлуорен для ТА98 и азид натрия для ТА 100. Число колоний-ревертантов (колонии клеток – обратных мутантов, у которых частично или полностью восстанавливаются признаки исходного организма) в опыте и контроле достоверно различались менее чем в 2,0 раза, что указывает об отсутствии мутагенного эффекта препарата на основе молочнокислых и пропионовокислых микроорганизмов. Препарат на основе пробиотических микроорганизмов имел низкий МИ равный 1,0-1,1 для штамма ТА98 и 0,96-1,07 – для штамма ТА100, что расценивается как отсутствие прямой мутагенной активности (Таблица 2).

Рисунок 1  – Мутагенная активность биопрепарата на основе молочнокислых и

пропионовокислых микроорганизмов: НК – негативный контроль (основа препарата), ПК – позитивный контроль (2-нитрофлуорен или азид натрия), ПМП – препарат ((1,4-1,6) × 10⁹)

Таблица 2 – Величина мутагенного индекса (МИ) биопрепарата на основе молочнокислых и пропионовокислых микроорганизмов

Показатель	Мутагенный индекс
	ТА98	ТА100
Негативный контроль (основа препарата)*	1	1
Позитивный контроль (2-нитрофлуорен или азид натрия)	3,8	9,6
Препарат ((1,4-1,6) × 109)*	1,0-1,1	0,96-1,07

Примечание: * - различия между вариантами статистически не значимы (р>0,05)

Следовательно, изучаемый препарат на основе молочнокислых и пропионовокислых микроорганизмов не вызывает мутации типа замены пар оснований и сдвига рамки считывания, поскольку не вызывает повышения частоты реверсий ни в штамме S. typhimurium ТА98, ни в ТА100.

Заключение. Таким образом, методами оценки индукции генных мутации, установлено, что пробиотический препарат и содержащиеся в нем метаболиты штаммов пробиотиков в качестве активного компонента не представляют мутагенной опасности.