Оценка потенциальной опасности для здоровья человека наночастиц оксида цинка

Землянова Марина Александровна – доктор медицинских наук, главный научный сотрудник, заведующий отделом биохимических и цитогенетических методов диагностики; доцент кафедры микробиологии и иммунологии (e-mail: ; тел.: 8 (342) 236-39-30; ORCID: .

Примером новых материалов, способных обеспечить данный переход, являются наноразмерные вещества. Замена микроразмерных материалов на наноматериалы в составе продукции позволяет улучшить ее механические, электрические, оптические, термодинамические и прочие свойства [1]. Это обеспечивается меньшим размером, более высокими значениями удельной площади и пористости поверхности наночастиц (НЧ).

Продвинутые физико-химические свойства продукции наноиндустрии обеспечивают ее востребованность, что способствует активному увеличению объемов производства. Это сопряжено с возрастающим количеством НЧ, поступающих в объекты окружающей среды в ходе процессов производства, эксплуатации и утилизации нанопродукции. В связи с этим возрастает риск здоровью населения и работающих при экспозиции наночастицами.

Благодаря малому размеру НЧ способны эффективнее преодолевать защитные барьеры организма, распределяться по организму и накапливаться в органах в сравнении с микроразмерными частицами сходного химического состава [2]. При дальнейшем взаимодействии с биоструктурами НЧ за счет большей удельной площади поверхности активнее вступают в химические реакции, в том числе перекисного окисления липидов, что приводит к увеличению генерации свободных радикалов, нарушению метаболических процессов и повреждению клеточных ультраструктур [2].

В связи с вышесказанным оценка безопасности НЧ для здоровья человека является актуальной гигиенической задачей и основой для разработки рекомендаций, направленных на минимизацию рисков здоровью населения и работающих при потреблении и производстве продукции наноиндустрии.

Одним из подходов к прогнозированию степени потенциальной опасности НЧ является критериальный анализ комплекса показателей, полученных на основе уже имеющейся в научной литературе информации об их свойствах и особенностях воздействия на биосистемы. Результаты прогнозирования позволяют определить спектр дальнейших исследований для разработки научно обоснованных гигиенических рекомендаций, направленных на минимизацию рисков здоровью.

Одним из активно применяющихся в хозяйственной деятельности человека наноматериалов являются НЧ оксида цинка (ZnO). Данный материал используют в качестве компонента в процессах производства продукции химической, фармацевтической (средства доставки лекарств, антибиотики, препараты для лечения сахарного диабета) [3], электронной (в светоизлучающих устройствах ультрафиолетового диапазона, солнечных батареях, газовых сенсорах, накопителях электроэнергии, транзисторах), сельскохозяйственной (в составе удобрений и кормов для сельскохозяйственных культур и животных) [4, 5], пищевой (в качестве консерванта и компонента упаковки пищевой продукции) [6, 7] и текстильной (в составе тканей, защищающих от ультрафиолета, бактерий, грибков, микроволн, электромагнитного излучения) промышленности [8]. Ежегодный мировой объем производства НЧ ZnO достигает 33 400 т/год, что характеризует его как крупнотоннажный промышленный продукт (производство > 1000 т/год) [9]. Широкий спектр сфер хозяйственной деятельности и высокие объемы производства разнопрофильной продукции, содержащей НЧ ZnO, а также поступление частиц в составе выбросов и сбросов в объекты среды обитания (атмосферный воздух, питьевая вода, пищевые продукты) позволяют предположить масштабную экспозицию населения и работающих.

В связи с этим оценка потенциальной опасности для здоровья человека НЧ ZnO является актуальной гигиенической проблемой и основой для разработки рекомендаций, направленных на минимизацию риска здоровью населения и работающих.

Данное исследование является продолжением цикла работ ФБУН «ФНЦ медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения» по оценке гигиенической безопасности для здоровья человека новых материалов, в том числе наноструктурных частиц [10, 11].

Цель исследования – оценка потенциальной опасности наноматериала для здоровья человека на примере наночастиц оксида цинка по данным литературы.

Материалы и методы. Исследование выполнено в соответствии с методическими подходами, описанными в МР 1.2.2522-09². Источники информации подбирали в соответствии с критериями, обозначенными в МР в требованиях к используемым информационным ресурсам (п. 4.4). Информацию о НЧ ZnO группировали по функциональным блокам, описывающим физические, физико-химические, молекулярно-биологические, цитологические, физиологические, токсические и экологические свойства.

Коэффициент частной опасности для функциональных блоков ( D_k ) рассчитывали как отношение суммы выраженности признаков наноматериала, входящих в функциональный блок, к сумме их максимально возможной выраженности с учетом взвешивающей функции по формуле:

D = k N max ,

X , = i R ^

где k – порядковый номер функционального блока;

– порядковый номер признака;

N – общее число признаков в блоке;

R – оценка выраженности признака в баллах;

R ^max – максимально возможная балльная оценка данного признака;

φ – значение «взвешивающей функции» для -го признака в зависимости от ранга.

Коэффициент потенциальной опасности ( D ) НЧ ZnO для здоровья человека рассчитывали как квадратный корень из суммы значений частной опасности каждого блока, возведенных во вторую степень, по формуле:

D = JZ D" ² ,              (2)

\ 2 = 1

где D_k – величина частной опасности функционального блока, k – порядковый номер блока.

В зависимости от полученного значения коэффициента D определяли степень потенциальной опасности (низкая, средняя или высокая).

Статистическую значимость выполненных расчетов определяли с помощью коэффициента неполноты оценки ( U ) по соотношению сумм взвешивающей функции для неопределенных и известных признаков НЧ ZnO:

U =

Kuw E25   , i=1^-

где U – коэффициент неполноты оценки;

u – коэффициент, принимающий значение «1», если -й признак признается неопределенным (информация отсутствует), и «0» – при любой другой оценке;

φ – величина «взвешивающей функции» данного признака.

Проведенная оценка считается статистически значимой при значении коэффициента U < 0,250.

Результаты и их обсуждение. Оценка физикохимических свойств и особенностей взаимодействия с биосистемами частиц ZnO показала, что анализируемые данные охватывают частицы практически всего наноразмерного диапазона (6 ~ 100 нм); частицы имеют преимущественно форму, приближенную к сферической3. При внесении в водную среду НЧ ZnO обладают слабой растворимостью (0,0029 г/дм3 при 20 °С) и образуют агломераты, что подтверждено увеличением гидродинамического диаметра в более чем 2 раза относительно размера частиц в порошкообразном наноматериале [12]. Слабая растворимость в водной среде может указывать на склонность вещества проявлять больше гидрофобные свойства, чем гидрофильные.

Водородный показатель среды является одним из факторов, влияющих на адсорбционную емкость частиц ZnO. При изменении рН с кислой на нейтральную значение адсорбционной емкости НЧ для таких красителей, как кислый фуксин и конго красный, увеличивается. Переход в щелочную среду снижает значение показателя. Наблюдается уменьшение адсорбции малахитового зеленого при увеличении рН с 3 до 6. Значения показателя достигали 3307 мг/г, что подтверждает высокую адсорбционную емкость НЧ ZnO [14].

В исследовании [15] отмечают влияние рН среды на поверхностный заряд НЧ ZnO. В нейтральной среде дзета-потенциал принимает положительные значения. При достижении рН 10,1 заряд становится нулевым и принимает отрицательные значения при дальнейшем увеличении водородного показателя. В жидкостях, моделирующих внутреннюю среду организма (рН 1,5–7,4), НЧ ZnO отрицательно заряжены [13].

Заряд НЧ ZnO влияет на характер их биопоступления. В эксперименте n v vo отрицательно заряженные НЧ, однократно поступавшие в организм крыс пероральным путем, абсорбируются в кровоток в большем количестве, чем частицы с положительным зарядом [16]. Поступая в кровоток, НЧ распространяются по организму и накапливаются в печени, почках и легких. Повышение содержания цинка в печени и почках также отмечено в исследовании на мышах, перорально экспонированных НЧ ZnO ежедневно в течение 13 недель, и крысах, подвергавшихся ингаляционной экспозиции [12, 17]. Данные результаты демонстрируют способность НЧ ZnO преодолевать энтеро- и аэрогема-тический барьеры организма.

На клеточно-молекулярном уровне мембраны являются биосистемным барьером, с которым НЧ ZnO взаимодействуют в первую очередь. При контакте с клеточной мембраной НЧ вызывают реорганизацию липидных компонентов, приводящую к нарушению ее целостности, что подтверждено в исследовании in vitro на клеточных линиях меланомы человека и мышей [18]. Деструкция липидов может быть обусловлена перекисным окислением свободными радикалами, продуцированными НЧ ZnO [19].

Отмечена способность НЧ преодолевать клеточную мембрану по механизму эндоцитоза [20]. Проникнув в клетку, они распространяются по цитоплазме и в результате внутриклеточного транспорта локализуются в лизосомах, везикулах и ядре [20–22]. В экспонированных клетках отмечается снижение митохондриального потенциала, что приводит к избыточной продукции свободных радикалов, в том числе активных форм кислорода [21].

Избыточная генерация внутриклеточных свободных радикалов инициирует повреждение надмолекулярных структур, таких как ДНК и белки. Подтверждено окислительное повреждение ДНК в исследовании in vivo в клетках головного мозга крыс, подвергавшихся ежедневной пероральной экспозиции НЧ ZnO в течение 7 суток [23]. Результаты исследования продемонстрировали увеличение содержания малонового диальдегида и снижение содержания супероксиддисмутазы, глутатиона и каталазы, что характерно при развитии окислительновосстановительного дисбаланса. Одновременно с этим методом ДНК-комет отмечают увеличение длины и интенсивности «хвоста», указывающее на фрагментацию ДНК. Данным методом получены сопоставимые результаты в исследовании in vitro , подтвердившие повреждение ДНК в сперматозоидах Scaphechinus mirabilis (плоский морской ёж) [24].

НЧ ZnO способны взаимодействовать с аминокислотными остатками белков (глицин, фенилаланин, аргинин, аспаргиновая кислота, глутамин, аспарагин), образуя с ними водородную, электростатическую или метал-акцепторную связь [25]. Связанные с НЧ аминокислоты подвергаются окислительным изменениям под воздействием свободных радикалов, что подтверждено по усилению карбонилирования белков у бактерий Deinococcus radiodurans , экспонированных наноразмерным ZnO [26].

Окислительное повреждение белков способствует изменениям протеомного профиля и метаболических процессов. В исследовании на дрожжах Saccharomyces cerevisiae [27] отмечено нарушение экспрессии белков, регулирующих метаболизм углерода, биосинтез кофакторов, аминокислот, жирных кислот, пуринов, пиримидинов, нуклеозидов и нуклеотидов. Это может привести к нарушениям антиоксидантной активности, энергетического метаболизма, стабильности клеточных мембран, повреждениям ДНК и белков.

Изменение экспрессии белков и дисметабо-лизм могут вызывать изменение морфологии и гибель клеток. В исследовании [28] клетки линии аденокарциномы базального эпителия альвеол человека после воздействия НЧ ZnO трансформировались, меняя форму с продолговатой на сферическую. Гибель клеток, вызванная воздействием НЧ ZnO, может проходить по пути апоптоза. При экспозиции клеток печени человека линии HepG2 отмечено снижение мембранного потенциала митохондрий, вызывающее увеличение экспрессии белка Bax и снижение экспрессии Bcl2 [19]. Увеличение соотношения Bax / Bcl2 подтверждает активацию процесса апоптоза.

Другой путь гибели клеток может быть связан с нарушением морфологии цитоскелета и ядерного матрикса. Установлено снижение жизнеспособности сперматогониальных клеток линии GC-1, экспонированных НЧ ZnO [29]. Результаты исследования подтвердили разнонаправленное изменение экспрессии α-тубулина, β-тубулина, F-актина и β-акти-на. Это указывает на нарушение целостности цитоскелета, обусловленное изменением экспрессии белков микротрубочек и микрофиламентов. Выявлено изменение морфологии клеточного ядра, сопряженного с увеличением экспрессии белков ядер-ного матрикса SUN1, LAP1 и ламин А/С, поддерживающего структуру органоида.

Нарушения, вызываемые НЧ ZnO на клеточномолекулярном уровне, вероятно, обусловливают органотоксические эффекты. В исследованиях in vivo установлено, что экспозиция НЧ ZnO вызывает морфофункциональные нарушения тканей печени, почек и легких. Гепатотоксичность НЧ ZnO подтверждена в исследовании на крысах, экспонированных внутрибрюшинно в течение 21 дня в дозе 2 мг/кг/сут. Результаты гистологического и гистохимического исследований позволили идентифицировать в ткани печени крыс синусоидальную дилатацию, гиперплазию клеток Купфера, воспалительный процесс, некроз, гидропическую дистрофию, апоптоз гепатоцитов, изменение размеров клеточных ядер и гемосидероз [30]. В другом исследовании [31] в сыворотке крови крыс, получавших внутрибрюшинные инъекции НЧ ZnO в течение 7 суток в дозе 25 мг/кг/сут, отмечено увеличение активности аланинаминотрансферазы (АЛаТ) и аспартатаминотрансферазы (АСаТ), что может являться результатом нарушения функции печени.

Нефротоксический эффект НЧ ZnO подтвержден при пероральной экспозиции в течение 14 суток в дозе 1000 мг/кг/сут. Биохимический анализ крови позволил установить увеличение содержания креатинина и азота мочевины, указывающее на нарушение функции почек. Патоморфологические изменения характеризуются некрозом эпителиальных клеток канальцев [32].

При однократной интратрахеальной экспозиции 20 мкг НЧ ZnO в жидкости бронхоальвеолярно- го лаважа мышей отмечено повышение содержания малонового диальдегида (МДА) и активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ); снижение антиоксидантной активности (АОА) [33]. В ткани легких отмечено развитие воспалительного процесса.

Результаты исследований in vivo позволили установить наличие у НЧ ZnO специфических эффектов в виде иммунотоксичности. При пероральной экспозиции в течение 14 суток в дозе 750 мг/кг/сут у мышей отмечено снижение активности естественных клеток-киллеров (NK-клетки), что указывает на подавление иммунитета [34].

Ослабление клеточного иммунитета может подтверждаться снижением экспрессии про- и противовоспалительных цитокинов, установленным у экспонированных мышей.

Средняя смертельная доза НЧ ZnO при пероральном пути поступления составляет > 2000 мг/кг массы тела (3-й класс опасности в соответствии с ГОСТ 12.1.007-764), ингаляционном – > 1,79 мг/дм3 (2-й класс), перкутанном – > 2000 мг/кг (3-й класс)5.

Составлена генеральная определительная таблица с определением оценки выраженности выявленных признаков НЧ ZnO (таблица).

Оценка выраженности признаков НЧ ZnO

Признак	Ранг	Величина взвешивающей функции ( ϕ )	Состояние признака	Оценка выраженности признака ( R )	Краткая характеристика НЧ ZnO, представленная в источнике	Источник
Блок 1. Физические характеристики
Размер	1	2	6–100 нм	2	Размер – 6–100 нм	Сноски 3 и 4 [12–24, 26–34]
Форма частиц	1	2	Близка к сферичной	2	Размер – 6–90 нм	Сноска 3 [16, 21–23, 28, 33, 34]
Блок 2. Физико-химические свойства
Растворимость в воде	1	2	Слаборастворимы	3	Размер – < 100 нм	Сноска 4
Растворимость в средах организма	2	1	Слаборастворимы	2	Размер – 28,2 нм, гидродинамический диаметр – 1976 нм	[23]
Заряд	1	2	Отрицательный	3	Размер – 28,2 нм, гидродинамический диаметр – 1976 нм	[13]
Адсорбционная емкость	3	0,75	Высокая	4	Размер – 10 нм, удельная площадь поверхности – 26,9 м2/г	[14]
Устойчивость к образованию агломератов	3	0,75	Низкая	0	Размер – 40 нм, гидродинамический диаметр – 201,8 нм, удельная площадь поверхности – 60 м2/г	[12]
Гидрофобность	4	0,5	Скорее гидрофобны	3	Размер – < 100 нм	Сноска 4
Адгезия к поверхностям	5	0,3125	Неизвестно	3	-	-
Генерация свободных радикалов	2	1	Установлена	4	Размер – 90 нм, форма – сферическая	[21]
Блок 3. Молекулярно-биологические свойства
Взаимодействие с ДНК	1	2	Установлено	4	Размер – 30 нм, гидродинамический диаметр – 272 нм, форма – сферическая	[23]
					Размер – 40–50 нм, гидродинамический диаметр – 200 нм, удельная площадь поверхности – 58 м2/г	[24]

Продолжение таблицы

Признак	Ранг	Величина взвешивающей функции ( ϕ )	Состояние признака	Оценка выраженности признака ( R )	Краткая характеристика НЧ ZnO, представленная в источнике	Источник
Взаимодействие с белками	3	0,75	Установлено	4	Размер – 1 нм (смоделировано в компьютерной программе)	[25]
					Размер – < 100 нм	[26]
Взаимодействие с мембранами	2	1	Установлено	4	Размер – 15 нм, удельная площадь поверхности – 65 м2/г	[18]
					Размер – 30 нм, гидродинамический диаметр – 267 нм	[19]
					Размер – 95 нм, гидродинамический диаметр – 262 нм, форма – различная	[20]
Блок 4. Цитологические свойства
Внутриклеточная локализация	2	1	Локализованы в органеллах и цитоплазме	4	Размер – 95 нм, гидродинамический диаметр – 262 нм, форма – различная	[20]
					Размер – 90 нм, форма – сферическая	[21]
					Размер – 30–50 нм, гидродинамический диаметр – 284,76 нм, форма – сферическая	[22]
Трансформирующее воздействие на клетки	1	2	Установлено	4	Наносферы: размер – 6–38 нм, гидродинамический диаметр – 183–505 нм, удельная площадь поверхности – 7–90 м2/г, форма – сферическая; Наностержни: размер (диаметр / длина) – 6–7 нм / 8–19 нм, гидродинамический диаметр – 481–593 нм, удельная площадь поверхности – 37–88 м2/г, форма – цилиндрическая	[28]
Трансформация протеомного профиля и метаболических реакций	3	0,75	Установлено	4	Размер – < 70 нм, гидродинамический диаметр – 60–150 нм	[27]
Цитотоксичность	1	2	Гибель неизмененных клеток	4	Размер – 30 нм, гидродинамический диаметр – 267 нм	[19]
					Размер – 88 нм, удельная площадь поверхности – 12 м2/г	[29]
Блок 5. Физиологические свойства
Пенетрация защитных барьеров организма	4	0,5	Установлено	4	Размер – 40 нм, гидродинамический диаметр – 201,8 нм, удельная площадь поверхности – 60 м2/г	[12]
					Размер – 20–70 нм, форма – сферическая	[16]
					Размер – 20 нм	[17]

Окончание таблицы

Признак Ранг Величина взвешивающей функции (ϕ) Состояние признака Оценка выраженности признака (R) Краткая характеристика НЧ ZnO, представленная в источнике Источник Бионакопление 2 1 Кумулирует в некоторых органах 3 Размер – 40 нм, гидродинамический диаметр – 201,8 нм, удельная площадь поверхности – 60 м2/г [12] Размер – 20–70 нм, форма – сферическая [16] Размер – 20 нм [17] Усиление проницаемости защитных барьеров для других токсикантов 3 0,75 Неизвестно 3 - - Острая токсичность 1 2 2-й класс опасности 4 Размер – < 100 нм Сноска 4 Хроническая токсичность 1 2 Токсично для гомойотермных животных 4 Размер – 35 нм [30] Размер – 20–50 нм, гидродинамический диаметр – 169,2 нм [31] Размер – 50 нм [32] Размер – 12,9 нм, гидродинамический диаметр – 304 нм, форма – сферическая [33] Специфические эффекты токсичности 1 2 Установлены 4 Размер – 29–79 нм, форма – сферическая [34] Блок 6. Экологическая характеристика Объем мирового производства 1 2 Крупнотоннажный промышленный продукт 4 - [9] Возможные масштабы экспозиции 1 2 Население в национальном масштабе 4 - [9] Бионакопление в организмах 2 1 Неизвестно 2 - - Накопление в объектах окружающей среды 3 0,75 Неизвестно 3 - - циал. При снижении заряда возрастает абсорбция НЧ ZnO в кровоток.

Проникая в организм, НЧ ZnO взаимодействуют с макромолекулами и надмолекулярными структурами. Увеличивая генерацию свободных радикалов, НЧ ZnO способны оказывать окислительное воздействие на клеточные структуры. Повреждение и нарушение функций данных структур обусловливают цитотоксический эффект изучаемого наноматериала, в том числе через изменение протеомного профиля и метаболических процессов, что в конечном счете может привести к гибели клетки. Экспозиция НЧ ZnO вызывает изменение экспрессии белков микротрубочек, микрофиламентов, ядерного матрикса и регуляторов процесса апоптоза, что приводит к гибели клетки.

Рассматривая особенности взаимодействия с биосистемами НЧ ZnO на тканево-органном уровне, стоить отметить увеличение концентрации цинка в печени, почках и легких экспонированных животных как при пероральном, так и при ингаляционном пути поступления в организм. Бионакопление в данных органах и цитотоксические свойства обусловливают развитие негативных эффектов, инициированных НЧ ZnO. Гепатотоксичность проявляется в цитолитическом эффекте (увеличение активности АЛаТ и АСаТ) и развитии патоморфологических изменений. В паренхиматозной ткани обнаружены гепатоциты с измененным размером ядер и подверженные апоптозу. Развиваются воспалительные, дистрофические и некротические процессы. Морфофункциональные изменения, отмеченные в почках, характеризуются нарушением процесса фильтрации (увеличение концентрации креатинина и азота мочевины) и развитием некроза эпителия. Токсический эффект НЧ ZnO для легких отмечен по развитию окислительно-восстановительного дисбаланса (увеличение МДА, снижение АОА), цитолиза (увеличение активности ЛДГ в

бронхоальвеолярной жидкости) и воспалительного процесса тканей. Исходя из особенностей бионакопления и морфофункциональных нарушений, печень, почки и легкие можно определить в качестве органов-мишеней НЧ ZnO.

Негативное воздействие на клетки обусловливает иммунотоксический эффект НЧ ZnO. У мышей, экспонированных НЧ ZnO, одновременно наблюдается снижение активности NK-клеток и снижение экспрессии про- и противовоспалительных цитокинов. Данные результаты указывают на гибель лимфоцитов и дисбаланс между про- и противовоспалительными системами цитокинов, что может привести к подавлению иммунных реакций.

Выводы. Установлена высокая степень потенциальной опасности НЧ ZnO для здоровья человека на основе реализации прогнозно-аналитической процедуры ( D = 2,102). Полученная оценка обеспечена совокупностью имеющихся свойств частиц оксида цинка практически всего наноразмерного диапазона (6~100 нм) и является статистически значимой ( U = 0,079). Результаты проведенного исследования свидетельствуют, что для полноты гигиенической оценки безопасности НЧ ZnO различных размеров в пределах нанодиапазона необходимо провести исследование отдаленных и специфических эффектов токсичности (генотоксичность, тератогенность, эмбриотоксичность, гонадотоксич-ность). Это позволит повысить эффективность разработки научно обоснованных мер профилактики, направленных на минимизацию рисков здоровью населения и работающих при экспозиции НЧ ZnO в ходе производства и потребления продукции.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.