Оценка резистентности к метициллину клинических штаммов стафилококков

Staphylococci play a great role in the emergence of various human illnesses. The most actual are infections caused by methicillin-resistant staphylococci.

The study of methicillin susceptibility as a polyresistance marker includes the definition of the minimum inhibitory concentration (MIC) of antibiotic which in vitro fully suppresses the visible growth of microorganisms in the standard experiment conditions and is expressed in absolute figures (mg/l or mkg/ml).

The aim of the research is the measure of MIC methicillin (oxacillin) for the clinical strains of staphylococci isolated from different clinical specimens and comparative analysis antibiotic’s MIC for Staphylococcus aureus and coagulasenegative staphylococci (CNS).

The result of the research is the determination of the oxacillin concentration preventing growth of the methicillin-resistant clinical strains of S.aureus and CNS which were detected from different profile hospitals of Saratov – general hospital №2, maternity hospital №6, children’s regional hospital and centre of combustiology.

The methicillin-resistant of the staphylococci clinical strains in the Saratov region has not been investigated before. Key words: methicillin, oxacillin, polyresistance, strains, staphylococci.

В последнее время распространение метициллинорезистентных штаммов стафило^о^^ов (MRS) представляет серьезн^ю проблем^ в стационарах раз-лично^о профиля. Та^ в ожо^овых отделениях на долю ^стойчивых ^ метициллин^ штаммов S.aureus (MRSA) приходится от 25 до 77%. Распространенность MRSA в травматоло^ичес^их стационарах составляет 45 – 67% от обще^о числа выделенных стафило^о^-^ов [8,9].

Не менее тревожные данные ^асаются обнар^-жения метициллино^стойчивых штаммов ^оа^^ла-зоне^ативных стафило^о^^ов (CNS). Есть данные [11] о том, что более 50% штаммов CNS являются резистентными ^ метициллин^, причем в основном они представлены S.epidermidis (MRSE) [2]. Та^, в отделении тора^альной хир^р^ии по данным Азизова И.С. [1] наряд^ с MRSA, на долю ^оторых приходилось до 25,6%, частота выделения MRSE составила 51,3%. В ожо^овых и травматоло^ичес^их отделениях анало^ичные штаммы S.epidermidis обнар^жены в 45% сл^чаев [4]. По данным др^^их авторов [7] эта цифра значительно выше и составляет 57,5%.

Наблюдается нарастание ^дельно^о веса метициллинорезистентных стафило^о^^ов, ^а^ MRSA, та^ и ^оа^^лазоне^ативных (MRCNS), в основном эпидермальных, среди всей поп^ляции стафило^о^^ов и ^ он^оло^ичес^их больных до 50% [13].

Устойчивые штаммы ми^роор^анизмов мо^^т воз-ни^ать различными п^тями, одна^о в любом сл^чае развитие резистентности ми^роор^анизмов связано с изменением ^енома ба^териальной ^лет^и. Формирование резистентности связано с дозиров^ой, длительностью применения антибиоти^а, частотой е^о использования в ^он^ретном лечебном ^чреж-дении, в частности, и в др^^их сферах деятельности, способностью ми^роор^анизма м^тировать, поддерживая ф^н^циональные способности, возможностью э^спрессии ми^роор^анизмами фа^торов ^стойчиво-сти, а та^же наличием фа^торов, способств^ющих передаче их др^^им особям [14,15,16]. Антиба^те-риальные препараты и^рают роль лишь селе^тивных а^ентов.

Распространение ^стойчивых вариантов штаммов ба^терий – ^омпле^с сложных биоло^ичес^их процессов, зависящих от свойств ми^роор^анизма, е^о ^енетичес^ой стр^^т^ры, особенностей использ^е-мых препаратов и т.д., а та^же та^их антропо^енных фа^торов, ^а^ пра^ти^а применения антибиоти^ов, ее длительность, социальные и э^ономичес^ие ^с-ловия, интенсивность ми^рации населения. К др^-^им фа^торам, способств^ющим распространению резистентности, относятся: нарастание имм^нодефи-цита и ^величение тяжести инфе^ций, назначение ^омбинаций антибиоти^ов при их лечении, использование антибиоти^ов и отходов антибиотичес^ой промышленности для вс^армливания животных, в сельс^ом хозяйстве [3].

Не менее важной проблемой, наряд^ с формированием и распространением антибиоти^орезистентности в э^осистемах ми^роор^анизмов и человечес^ой поп^-ляции, является селе^ция резистентных штаммов [6].

Опасность приобретения стафило^о^^ами резистентности ^ метициллин^ вызвана не столь^о поте- рей а^тивности ^ относительно мало применяемо^о в настоящее время метициллина, с^оль^о тем, что ^ метициллинорезистентных штаммов наблюдается пе-ре^рестная ^стойчивость ^ в-ла^тамам, относящимся, в перв^ю очередь, ^ изо^сазолиловой ^р^ппе (о^-сациллин, ^ло^сациллин и др), цефалоспоринам ши-ро^о^о спе^тра действия [5,10]. Эпидемичес^ие штаммы MRS проявляют множественн^ю резистентность ^ антибиоти^ам, в том числе амино^ли^озидам, ма^ро-лидам, лин^озамидам. Та^, частота ассоциированной ^стойчивости MRS ^ ма^ролидам, лин^озамидам, тет-раци^линам, ^ентамицин^ (^а^ мар^ер^ ^стойчивости ^о всем амино^ли^озидам), хлорамфени^ол^ превышает 40–80%, что делает применение перечисленных прапаратов в ^линичес^ой пра^ти^е проблематичным [12].

Материалы и методы. 97 ^линичес^их штаммов стафило^о^^ов были пол^чены из различно^о пато-ло^ичес^о^о материала (материал от новорожденных, ^ной, раневое отделяемое, маз^и из зева и носа взрослых пациентов, с поверхности ожо^овых ран) в лечебных ^чреждениях ^.Саратова. К^льт^ры стафило-^о^^ов выделяли на желточно-солевом а^аре (1,8% питательный а^ар, 7,5^ NaCl на 100 мл среды, 1% яич-но^о желт^а).

Та^ ^а^ метициллин в настоящее время в меди-цинс^ой пра^ти^е не использ^ется и отличается нестабильностью при хранении, для определения ч^в-ствительности стафило^о^^ов ^ метициллин^ использовали о^сациллин.

Для дете^ции метициллинорезистентности применяли метод с^ринин^а на плотной питательной среде Muller-Hinton (HISPAN LAP, Pronadisa (Madrid)) с добавлением 4% NaCl и 6,0 м^^ о^сациллина (ОАО «Боисин-тез»).

Величин^ минимальной подавляющей ^онцен -трации (МПК) о^сациллина определяли методом серийных разведений со^ласно МУК 4.2.1890-04. Для при^отовления основно^о раствора антибио-ти^а использовали с^бстанцию о^сациллина с известной а^тивностью. Рабочий раствор антибио-ти^а ^отовили из основно^о с использованием жид^ой питательной среды, та^им образом, чтобы пол^чить дв^^ратные разведения от 1000 до 0,5 м^^/мл.

Для ино^^ляции стандартн^ю ми^робн^ю взвесь, э^вивалентн^ю 0,5 по стандарт^ McFarland (1,5x108 КОЕ/мл), разводили питательным б^льо-ном до ^онцентрации 106 КОЕ/мл. После внесения ино^^люма в пробир^и с раствором антибио-ти^а ^онечная ^онцентрация ми^роор^анизмов до-сти^ала 5х105 КОЕ/мл. Одновременно ставили «отрицательный» ^онтроль с питательным б^льоном без антибиоти^а.

Параллельно проводили тестирование ^онт-рольных (референсных) штаммов (S.aureus ATCC 38591 – резистентный, S.aureus ATCC 29213 – ч^в-ствительный), при этом серия разведений в^люча-ла по^раничные ^онцентрации и доп^стимые диапазоны МПК для ч^вствительных и резистентных штаммов.

Пробир^и ин^^бировали при температ^ре 35єС в течение 24 часов. Учет рез^льтатов проводили виз^-ально. За МПК принимали минимальн^ю ^онцентра- цию оксациллина, при которой подавлялся видимый рост исследуемого штамма.

Принято считать, что к метициллинорезистентным относятся штаммы S.aureus, для которых МПК оксациллина равен 4 мкг/мл и более, в то время как для CNS эта величина должна быть не менее 0,5 мкг/мл. В связи с этим определение чувствительности штаммов S.aureus к оксациллину (метициллину) проводили в диапазоне концентраций препарата от 4 до 1000 мкг/мл, а коагулазонегативных (CNS) - от 0,5 до 1000 мкг/мл. Однако следует отметить, что CNS штаммов, для которых МПК составляла 0,5; 1,0; 2,0 мкг/мл, обнаружено не было. Поэтому если концентрация оксациллина 4 мкг/мл не задерживала рост микроорганизмов, такие ста-фило^о^^и расценивались ^а^ ч^вствительные ^ оксациллину, в то время как штаммы, для которых МПК была 4 мкг/мл и более, идентифицировались как метициллинорезистентные.

Результаты и обсуждение. В табл. 1 и 2 представлены данные о частоте (в абсолютных числах и в %), с которой встречаются отдельные значения МПК в диапазоне от 4 до 1000 мкг/мл. Данные приведены в отношении всех стафилококков и отдельно для S.aureus и CNS.

Из табл. 1, видно, что концентрация оксациллина менее 4 мкг/мл не подавляла рост ни одного из изученных штаммов S.aureus и CNS. В связи с этим все выделенные культуры можно считать метициллинорезистентными.

Лишь для 5,1% штаммов МПК оксациллина равнялась 4 мкг/мл. Концентрации антибиотика в пределах от 8 до 250 мкг/мл подавляли рост от 6,2 до 10,3% штаммов, в то время как МПК 500 и 1000 мкг/мл - 17,5 и 28,9% соответственно, что де-монстрир^ет высо^^ю резистентность данных штаммов к антибиотику. Рост 50% стафилококков подавлялся концентрацией оксациллина 167 мкг/ мл (МПК50).

Условно мы разделили метициллинорезистентные стафилококки на штаммы с низким (МПК 4-16 мкг/мл), средним (МПК 31,25 - 250 мкг/мл) и высоким (МПК 500 мкг/мл и выше) уровнем устойчивости. Как видно из табл. 1, почти половина изученных ^^льт^р обладали высо^им ^ровнем ^стойчивости ^ оксациллину, в то время как штаммов с низким уровнем устойчивости было менее трети. По нашему мнению, это может служить подтверждением того, что формирование устойчивости штаммов стафилококков к метициллину в стационарах г.Саратова происходило достаточно длительное время, что и привело ^ цир^^ляции штаммов с высо^им ^ровнем устойчивости.

При сравнении уровней устойчивости S.aureus и коагулазонегативных стафилококков (табл.2) можно отметить, что имеются существенные различия в величинах МПК оксациллина для S.aureus и CNS. Так, лишь 12,5 и 6,3% штаммов S.aureus устойчивы к высоким концентрациям оксациллина (500 и 1000 мкг/ мл), тогда как среди CNS этот показатель составил 20 и 40%. В то же время соотношение аналогичных штаммов, рост которых ингибирован 4 мкг/мл антибиотика, равно 1:1 (6,3% и 6,2% соответственно). Число штаммов, обладающих средним уровнем устойчивости, среди S.aureus составило от 6,3 до 18,7%, а среди CNS - от 4,6 до 6,2%. Это свидетельствует, о том, что среди CNS существенно преобладают штаммы, устойчивые к высоким концентрациям оксациллина, в то время как в популяции S.aureus в основном циркулируют штаммы со средним уровнем устойчивости к данному антибиотику, а также отражают высокую адаптационную способность и пластичность штаммов CNS.

В табл. 3 представлены МПК оксациллина для штаммов стафилококков, выделенных из различного патологического материала. Из таблицы видно, что наибольшее количество метициллинорезистентных стафилококков составили штаммы, выделенные от новорожденных (46), из раневого отделяемого (32) и материала из зева и носа (15 штаммов). Оставшееся число штаммов выделено из мочи (1) и гноя (1).

Применив принцип, использованный ранее, можно разделить штаммы на ^р^ппы по ^ровню резистентности к данному антибиотику. При этом из материала, выделенного от новорожденных, количество штаммов с низким уровнем резистентности составило 26,1%, со средним - 21,7%, с высоким - 52,2%. В мазках из зева, носа штаммы распределились соответственно уровням - 0%, 20%, 80%, в раневом отделяемом - 28,1%, 53,1%, 18,8%. Таким образом, подавляющее большинство штаммов из материала от новорожденных, в мазках из зева и носа относится к группе с высокой степенью резистентности к оксациллину (МПК 500 мкг/мл и более). Однако и в раневом отделяемом такие штаммы составили около 20%, что, безусловно, следует учитывать в клинической практике. Таким образом, большинство выделенных штаммов имеют высо^ий и средний ^ровни резистентности, что указывает на преобладание таких штаммов в популяции метициллинорезистентных стафилококков.

Выводы

• 1.    В популяции стафилококков заметно преобладание штаммов, для которых МПК оксациллина составили 250 мкг/мл и более (46,4% от общего числа стафилококков), в то время как штаммы с низким уровнем резистентности составили менее трети. Это является косвенным свидетельством длительной селекции высокорезистентных штаммов в условиях стационара.

• 2.    Коагулазонегативные стафилококки составляют большинство среди штаммов, характеризующихся высокой степенью устойчивости к метициллину (оксациллину). Соотношение MRCNS и MRSA составляет более чем 2:1, что указывает на большую адаптаци-онн^ю способность та^их ^^льт^р и их несомненн^ю эпидемиологическую опасность.

• 3.    Устойчивые к метициллину стафилококки чаще выделялись из материала, полученного от новорожденных и раневого отделяемого (46 и 32 соответственно), при этом высокорезистентные штаммы составили от 20 до 50%. Независимо от вида патологического материала, в нем преобладали штаммы со средним и высоким уровнем устойчивости к метициллину, что является подтверждением распространенности таких штаммов в стационарах г.Саратова.

Таблица 1

Распределение штаммов стафило^о^^ов по величине МПК о^сациллина

МПК мкг/мл	MRS
	Абс	%	2 %
1000	28	28,9	100
500	17	17,5	71,1
250	7	7,2	53,6
125	9	9,3	46,4
62,5	9	9,3	37,1
31,25	6	6,2	27,8
16	10	10,3	21,6
8	6	6,2	11,3
4	5	5,1	5,1
2	-	-	-
1	-	-	-
0,5	-	-	-
Итого	97	100	-
МПК50	167,91±17,8 мкг/мл

Таблица 2

Распределение S.aureus и ^оа^^лазоне^ативных стафило^о^^ов по величине МПК о^сациллина

МПК мкг/мл	S.aureus			CNS
	абс	%	2 %	Абс	%	2 %
1000	2	6,3	100	26	40	100
500	4	12,5	93,7	13	20	60
250	3	9,3	81,2	4	6,2	40
125	5	15,6	71,9	3	4,6	33,8
62,5	6	18.7	56,3	3	4,6	29,2
31,25	2	6,3	37,6	4	6,2	24,6
16	4	12,5	31,3	6	9,2	18,4
8	4	12,5	18,8	2	3,0	9,2
4	2	6,3	6,3	4	6,2	6,2
2				-	-	-
1				-	-	--
0,5				-	-	-
Итого	32	100		65	100
МПК50	45,02±4,4 мкг/мл			375±1,2

Доверительный интервал для 95% штаммов - 0,05%

Таблица 3

Величина МПК (мкг/мл)	Всего	Низкий уровень				Средний уровень					Высокий уровень
		Всего	в том числе МПК			Всего	в том числе МПК				Всего	в том числе МПК
			4	8	16		31,25	62,5	125	250		500	1000
Материал от новорожденных	46 100%	12 26,1%	2 4,3%	3 6,5%	7 15,2%	10 21,7%	5 11%	2 4,3%	3 6,5%	-	24 52,2%	10 21,8%	14 30,4%
Мазки из зева, носа	15 100%	-	-	-	-	3 20%	-	1 6,7%	1 6,7%	1 6,6%	12 80%	3 20%	9 60%
Мокрота	2 100%	-	-	-	-	-	-	-	-	-	2 100%	1 50%	1 50%
Моча	1 100%	-	-	-	-	1 100%	-	-	-	1 100%	-	-	-
Гной	1 100%	-	-	-	-	-	-	-	-	-	1 100%	1 100%	-
Раневое отделяемое	32 100%	9 28,1%	3 9,4%	3 9,4%	3 9,4%	17 53,1%	1 3%	6 18,8%	5 15,6%	5 15,6%	6 18,8%	2 6,3%	4 12,5%
Количество штаммов с данной МПК	97	21	5	6	10	31	6	9	9	7	45	17	28

Распределение штаммов метициллинорезистентных стафило^о^^ов, выделенных из различно^о патоло^ичес^о^о материала, по величине МПК о^сациллина